摘  要：文章建立了L-叔亮氨酸的快速检测方法，并探讨了其在催化转化工艺优化中的应用。首先，采用薄层色谱法进行定性分析，发现随着L-叔亮氨酸浓度增加，红色斑点颜色逐渐加深，表明薄层色谱法可用于快速监测催化过程中L-叔亮氨酸的生成。其次，通过紫外分光光度分析发现，在215 nm 波长处，L-叔亮氨酸的吸光度显著高于其前体三甲基丙酮酸，可通过监测 215 nm 处的吸光度间接定量 L-叔亮氨酸的生成量。最后，优化了邻苯二甲醛衍生-高效液相色谱法的检测条件，采用依利特 C18  ODS 反相色谱柱，设置流动相为20 mmol/L 乙酸钠缓冲溶液（pH 4.0）与甲醇-乙腈（1 ∶ 1）混合液（体积比 3 ∶2），流速 0.8 mL/min，检测波长 340 nm。实验结果表明，薄层色谱法、紫外分光光度法和高效液相色谱法 3 种方法对L-叔亮氨酸标准品及催化转化样品的检测均具有较高的可靠性和准确性，为手性氨基酸的工业化生产提供了有效的分析手段和工艺优化依据。

       关键词：L-叔亮氨酸；薄层色谱法；紫外分光光度法；高效液相色谱法

       在 L-叔亮氨酸的工业生产过程中，监测产物的生成具有重要意义。传统检测方法利用氨基酸分析仪完成，不仅价格昂贵，而且检测条件复杂、耗时久，不适用于工业生产中的快速分析。目前，针对 L-叔亮氨酸常见的检测方法包括圆二色谱法、荧光法、旋光检测法、气相色谱法及液相色谱法等[1-5]，各有利弊。例如：旋光检测法对样品需求量大且易受杂质干扰[6]；色谱法虽然目前应用广泛且分析效果相对较好，但存在前期准备复杂、分析耗时久、手性色谱柱价格昂贵等缺点[7-8] 。因此，建立新的方法用于 L-叔亮氨酸的快速检测并对其展开定量定性分析具有重要意义。

       薄层色谱法是一种能快速分离并定性分析少量物质的技术，常被用于跟踪反应进程。紫外分光光度法根据不同物质对光具有选择吸收性的特点，通过测定特定波长下物质吸光度差异实现定性和定量分析。该方法因简单、快速、准确度高、重现性好等优点，被广泛应用于手性氨基酸的检测[9-10] 。高效液相色谱法在手性氨基酸分析中得到广泛应用。其中，邻苯二甲醛柱前衍生法凭借衍生步骤简单、反应速度快、反应剩余试剂对后续测定不干扰等，表现突出[11]。本文分别探讨薄层色谱法和紫外分光光度计法在L-叔亮氨酸定性和定量检测中应用的可能性，以期在生物合成 L-叔亮氨酸过程中实现快速检测，并摸索高效液相色谱法定量检测 L-叔亮氨酸的测定条件，为生物催化合成 L-叔亮氨酸定量定性检测提供参考。

       1   材料与方法

       1.1   主要试剂

       L-叔亮氨酸标准品、正丁醇、冰醋酸、茚三酮、邻苯二甲醛、3-巯基丙酸等，购自国药集团化学试剂有限公司；5× 10 cm G 型硅胶板，购自青岛海洋化工有限公司。薄层层析展开缸，购自上海信谊仪器厂；C18  ODS 依利特反向色谱柱，购自 Waters 公司。

       1.2   检测方法

       1.2.1   生物合成 L-叔亮氨酸

       从 4 ℃冰箱中保存的抗性平板上挑取重组大肠杆菌 E. coli BL21/pET28α  (+)-ldh 单菌落接种到终浓度为 30 μg/mL 卡那霉素的装液量为 10 mL 灭菌后的 LB 液体培养基中，在 37 ℃、200 r/min 条件下过夜培养得到种子培养液。按 1%的接种量将种子培养液接种到终浓度为 30 μg/mL 卡那霉素的500 mL装液量为 100 mL 的发酵培养基中，37 ℃、200 r/min培养至菌体浓度 OD600 nm 为 0.8～1.0 时添加终浓度为0.4 mmol/L 的 IPTG，并调整发酵条件为 30 ℃、180 r/min诱导培养 8 h，4 ℃、10 000 r/min 离心 8 min 后收集菌体。将离心收集的菌体按浓缩 20 倍的比例加入50 mmol/L pH 7.5 的磷酸盐缓冲溶液悬浮，置于冰浴中超声波（功率 300 W，超声时间 4 s，间隔时间6 s，超声次数 60 次）破碎菌体。将破壁后的菌体12 000 r/min 冷冻离心 20 min，收集上清液，即得亮氨酸脱氢酶的粗酶液。亮氨酸脱氢酶活力的测定参考文献 [12]。称取一定量的甲酸铵于 500 mL 锥形瓶中，直接加入 100 mL 去离子水溶解，用 40% NaOH调节 pH 至 8.5，再取一定体积的甲酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶粗酶液使终酶活为2.0 U/mL ，加入 NAD+ 0.04 g 于反应液，滴加一定量配制好的2 mol/L 三甲基丙酮酸，持续 4～5 h，35 ℃、180 r/min 振荡反应，后将反应液加热至 70～80 ℃ , 保温 10 min，使蛋白质变性，6 700 r/min 离心 30 min，分离蛋白，4 ℃保存上清液备用。对照组：在转化反应刚开始时将反应液直接加热至70～80 ℃ , 保温一段时间使蛋白质变性，6 700 r/min 离心 30 min，分离蛋白，保存上清液备用。空白组：将不加酶液的催化反应液与样品液转化同等时间后，6 700 r/min 离心 30 min，分离得到上清液备用。

       1.2.2   薄层色谱法

       按正丁醇 ∶冰醋酸 ∶水=3  ∶ 1 ∶ 1（V/V）的比例配制展开剂，在硅胶板距底端 1.5 cm 处划一条线，用铅笔在点样原点做记号，用枪头（最大量程为 10 μL）分别吸取 L-叔亮氨酸标样液、样品液、空白对照液进行点样。2 个样品间距约 1.5 cm，每点完一滴待干后再继续点样，重复 4 次，点样后原点扩散直径<2 mm。将点完样的硅胶板竖直放入层析槽，并将一端浸入展开剂，待展层剂扩散到距离硅胶板顶端 1 cm 时，取出硅胶板。将硅胶板放入通风橱中晾干，浸入含1%茚三酮的异丙醇显色剂中 3 s ，用吹风机吹干即可见检测结果。

       1.2.3   紫外分光光度法

       三甲基丙酮酸和 L-叔亮氨酸标准曲线的建立：称取一定量的三甲基丙酮酸和 L-叔亮氨酸，溶解于催化转化反应体系中，制备成浓度为 0.2、0.4、0.6、 0.8、1.0 和 1.2 mmol/L 的系列溶液，用紫外分光光度计在 190～400 nm 区间进行紫外全波长图谱扫描，确定最佳检测波长，测定其在最佳波长的吸光度，建立线性回归方程，绘制标准曲线。

      1.2.4   高效液相色谱法

      1.2.4.1   邻苯二甲醛衍生化方法

      0.4 mol/L 硼酸钠溶液：称取 0.248 g 硼酸和0.141 g NaOH 于 10 mL 去离子水中溶解。

      邻苯二甲醛衍生试剂的配制：称量 50 mg 邻苯二甲醛和 1 mL 甲醇于 10 mL 硼酸钠溶液（0.4 mol/L， pH 9.6）中，用 NaOH 调 pH 至 10.0，加入 100 μL 3-巯基丙酸混匀，4 ℃保存备用[13]。

      样品溶液的制备：取 10 mL 样品液在 4 500 r/min条件下离心 10 min，得到上清液，保存备用。

      衍生条件：将待测液与邻苯二甲醛衍生试剂按1 ∶ 1（V/V）混合加入 EP 管，漩涡振荡 2 min 后用0.45 μm 微孔滤膜过滤后进样。

      1.2.4.2   色谱条件

      色谱柱：依利特 C18 ODS 反向色谱柱，4.6×250mm。

      流动相：A：20% 20 mmol/L 乙酸钠缓冲溶液，用1%稀乙酸调 pH 至 7.2；B：甲醇与乙腈 1 ∶ 1 混合；流动相 A ∶流动相 B=6 ∶4。将配制好的流动相先经过 0.45 μm 微孔滤膜过滤，再用超声波进行脱气处理。检测波长：340 nm，体积流量：0.8 mL/min。

      2   结果与分析

      2.1   L-叔亮氨酸薄层色谱检测结果与分析

      薄层色谱法重现性好、专一性强，且反应快速，是一种有效的定性检测手段[14]。将配制好的 0.3 mg/mL  L-叔亮氨酸标准溶液依次稀释成 0.1 mg/mL、0.03 mg/mL 进行点样，层析完成后取出，晾干观察显色。结果显示，L-叔亮氨酸标样与茚三酮显色后在硅胶板上出现红色斑点，颜色深浅呈现明显差异，比移值（Rf）为 0.62。当 L-叔亮氨酸标样浓度为 0.03 mg/mL时，在薄层色谱板上几乎观察不到红色斑点，随着L-叔亮氨酸浓度增加，红色斑点颜色逐渐加深，说明浓度越高显色越明显（见图 1a）。因此，可通过薄层色谱法快速初步检测催化转化反应过程中 L-叔亮氨酸的生成，定性分析反应的进展情况。

      标品、样品及空白对照的薄层色谱图显示，空白液在 Rf 值 0.62 处不显色，而样品在此处呈现红色，可初步判断生物催化合成了 L-叔亮氨酸（见图1b）。结果表明，在催化转化反应过程中可通过薄层色谱法对 L-叔亮氨酸进行定性分析，实时监测产物L-叔亮氨酸的生成情况。

      2.2   紫外分光光度法检测 L-叔亮氨酸方法的建立

      2.2.1   紫外检测波长的选择及标准曲线的绘制

      紫外分光光度法具有灵敏度高、准确度高、选择性好、分析成本低、操作简便快速等优点，在生物化学、食品检验、环境保护、肿瘤诊断、药物成分检测等领域和工业生产中均得到广泛应用[15-17] 。取相同摩尔浓度的催化底物三甲基丙酮酸和 L-叔亮氨酸溶液，用紫外分光光度计进行紫外全波长图谱扫描，结果如图 2 所示。三甲基丙酮酸的最大吸收峰和 L-叔亮氨酸的最大吸收峰均接近 200 nm。同等摩尔浓度的三甲基丙酮酸和 L-叔亮氨酸溶液在215 nm 处的吸光度及其线性回归方程如图 3 所示。在同等摩尔浓度条件下，215 nm 处 L-叔亮氨酸的吸收度远高于三甲基丙酮酸，且 2 种物质对应趋势线的 R2 值均>0.99，说明在 0.2～1.2 mmol/L 浓度范围内呈现良好的线性关系。

      2.2.2   真度检测

      以 1.2 mmol/L 为基准，分别对 0.8、0.6 和0.4 mmol/L浓度下的 L-叔亮氨酸标准溶液进行 3 次重复检测。

      根据 215 nm 处吸光度计算平均回收率，得到 3 次实 验 的 平 均 回 收 率 分别 为 100.02% 、99.67% 和100.39%，均在判定基础 99.5%～100.5%范围内。

      2.2.3   精密度实验

      将以上 3 个浓度的 L-叔亮氨酸重复测定 5 次，分别计算回收率和平均回收率，求出标准偏差及对应的相对标准偏差。结果显示 ，相对标准偏差为0.09%，低于判定标准 1%，说明该方法的精密度可靠。

      综合上述结果，采用紫外分光光度法测定反应体系在215 nm 处吸光度的变化情况，计算产物 L -叔亮氨酸的生成量。

      2.3   高效液相色谱法检测 L-叔亮氨酸方法的建立

      相比紫外分光光度法，高效液相色谱法具有分离效率高、专属性强、检测准确度可靠等优点，但试剂成本高、操作复杂、检测时间长，不适用于催化转化反应的快速检测。

      2.3.1   流动相配比的选择

      流动相配比的选择对 L-叔亮氨酸的出峰时间和分离效果影响显著。需将欲分离组分与相邻组分完全分离，同时考虑出峰时间的长短。本文考察了流动相 A 与 B 不同配比对 L-叔亮氨酸出峰效果及时间的影响（见表 1）。结果表明，选用流动相配比A ∶B=6 ∶4 时效果最好。

      2.3.2   L-叔亮氨酸标准品图谱分析

      取 500 μL 标准溶液与 500 μL 邻苯二甲醛试剂混合，在漩涡振荡器上振荡反应 2 min 后用0.45 μm微孔滤膜过滤后进样，得到 L-叔亮氨酸标准品的高效液相色谱图（见图 4）。

      取 500 μL 空白溶液与 500 μL 邻苯二甲醛试剂混合，在漩涡振荡器上振荡反应 2 min 后用0.45 μm微孔滤膜过滤后进样，得到 L-叔亮氨酸空白溶液的高效液相色谱图（见图5）。

      取 500 μL 对照溶液与 500 μL 邻苯二甲醛试剂混合，在漩涡振荡器上振荡反应 2 min 后用0.45 μm微孔滤膜过滤后进样，得到 L-叔亮氨酸空白溶液的高效液相色谱图（见图6）。

      对比发现，标样从左边起第一个峰为对照峰，第二个峰为经邻苯二甲醛衍生生成的目的峰，出峰时间为 9.608 min，说明邻苯二甲醛衍生法能灵敏快速地检测出催化体系中的 L-叔亮氨酸，但是峰形不够平滑。造成这种现象的原因可能是邻苯二甲醛衍生剂与产物 L-叔亮氨酸反应生成的产物不稳定、易分解。

      2.3.3   L-叔亮氨酸标准曲线的建立

      将 L-叔亮氨酸标准品配制成含量为300 μg/mL的水溶液，梯度稀释至 100、50、30 和 10 μg/mL。分别用上述高效液相色谱法进行检测，根据 L-叔亮氨酸含量及对应的峰面积绘制标准曲线（见图7）。结果显示，R2=0.999 2>0.99，说明趋势线的拟合程度较高，误差在可接受范围内，能满足实验要求。重复进样测试，所得峰面积与标准曲线计算出的结果偏差较小，精确度可靠，可用于后续产物 L-叔亮氨酸的转化率的分析。

      2.3.4   真度检查

      以 300  μg/ mL 为基准 ，分别对 200、160 和120  μg/mL 的 L-叔亮氨酸的标准溶液进行 3 次重复检测。根据所得峰面积计算平均回收率，得到 3次实验的平均回收率分别为 99.92%、100.17% 和99.87%，均在判定基础 99.5%～100.5%范围内。

      2.3.5   精密度实验

      采用上述 3 个浓度的 L-叔亮氨酸重复进样 5次，分别计算回收率和平均回收率，求出标准偏差及对应的相对标准偏差。结果显示，相对标准偏差为0.39%，低于判定标准 1%，说明该方法精密度可靠。

      3   结论

      薄层色谱法结果显示，随着 L-叔亮氨酸浓度增加，红色斑点颜色逐渐加深，说明可采用薄层色谱法快速定性检测催化过程中产物 L-叔亮氨酸的生成情况。在摩尔浓度相同的条件下，L-叔亮氨酸 OD215 nm 远大于三甲基丙酮酸，可利用催化体系在 215 nm 处的吸光度变化间接反映 L-叔亮氨酸的生成量，并据此建立 L-叔亮氨酸的快速检测方法。采用邻苯二甲醛对 L-叔亮氨酸进行衍生后，可用高效液相色谱法精确检测 L-叔亮氨酸。检测色谱条件为：依利特C18  ODS 反向色谱柱，流动相 A 为 20% 20 mmol/L乙酸钠缓冲溶液，B 为甲醇与乙腈 1 ∶ 1 混合，以A ∶B=3 ∶2 恒速洗脱，流速 0.8 mL/min ，检测波长340 nm。

      在催化转化工艺优化过程中可先通过薄层色谱法对 L-叔亮氨酸进行定性分析，监测在催化反应过程中产物 L-叔亮氨酸的生成情况，利用紫外分光光度法筛选出最佳的催化转化条件，并采用高效液相色谱法对最优结果进行验证。上述 3 种检测方法对于 L-叔亮氨酸标准品及催化转化样品的监测均具有很高的可靠性，对后续手性氨基酸的工业化生产起到指导意义。

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