摘要：为进一步提高β-甘露聚糖酶产量，文章测定了Prs过表达重组β-甘露聚糖酶生产菌株枯草芽孢杆菌M2对靶向核糖体11种抗生素的耐受谱。经产酶活性初筛，得到17株β-甘露聚糖酶活力较高的菌株。经发酵后测定发酵液酶活，复筛得到3株抗性突变株Par5、Gen17、Gen3，其酶活较原始菌株均提高约20%。1株抗性突变株Str25的发酵液酶活较原始菌株提高29.90%，酶产量达6 516 U/mL。

　　关键词：核糖体工程；耐受谱；β-甘露聚糖酶

　　核糖体工程是一种通过靶向核糖体的抗生素引入耐药性突变调节核糖体成分（核糖体蛋白或rRNA），从而增加微生物次级代谢产物产量的技术[1]。β-甘露聚糖酶因能水解甘露聚糖类有机物，被广泛应用于医药、食品、饲料和精细化工等领域[2-3]。课题组在前期研究中采用胞外分子伴侣PrsA脂蛋白的过表达技术构建了重组β-甘露聚糖酶生产菌株枯草芽孢杆菌M2，并通过生产工艺优化，将β-甘露聚糖酶产量提高到5 016 U/mL[4]。然而，商业应用需要更高水平的酶产量[5]。本文运用核糖体工程对枯草芽孢杆菌M2进行诱变选育，旨在得到β-甘露聚糖酶产量更高的突变菌株。

　　1材料与方法

　　1.1材料与设备

　　菌种：PrsA过表达重组产β-甘露聚糖酶生产菌株枯草芽孢杆菌M2，由课题组前期构建并保藏。

　　试剂：链霉素、庆大霉素、四环素、新霉素、克林霉素、卡那霉素、巴龙霉素、氯霉素、夫西地酸、利福平、红霉素、DNS试剂、β-甘露聚糖、D-甘露糖，均为分析纯，购自索莱宝生物科技有限公司。

　　培养基：LB培养基；产酶活性初筛培养基[6]（魔芋粉15 g/L，蛋白胨10 g/L，KH2PO4 0.2 g/L，MgSO40.1 g/L，琼脂20 g/L）；产酶活性验证培养基[4]（葡萄糖25 g/L，魔芋粉20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，MnCl2 0.1 g/L，CaCl2 0.3 g/L，pH 6.5）。

　　仪器设备：电热恒温培养箱，购自上海跃进医疗器械有限公司；超净工作台，购自Thermo；分光光度计，普析通用。

　　1.2方法

　　1.2.1枯草芽孢杆菌M2的抗生素耐受性测定

　　取200μL含106 mL-1枯草芽孢杆菌M2的细胞悬液涂布含抗生素的LB平板，37℃培养24 h。以M2菌株在不含抗生素LB平板的生长状态为对照，观察不同抗生素浓度下菌株生长情况，保藏耐受最高抗生素浓度的培养物作为后续突变株筛选的起始菌株。

　　1.2.2抗性突变株的筛选

　　取200μL含106 mL-1起始菌株的细胞悬液涂布于含抗生素的LB平板，37℃培养24 h。将长出的单菌落划线至含对应抗生素浓度的LB平板，经多次验证(≥5次），获得稳定遗传的单一抗性突变株，保藏用于后续产酶活性测定。

　　1.2.3抗性突变株产酶活性初筛

　　将抗性突变株点种于初筛培养基，37℃培养24 h[6]。测量水解圈直径，平行做3个重复试验。

　　1.2.4抗性突变株产酶活性复筛

　　将M2菌株或抗性突变株接种到LB液体培养基，装液量50 mL/250 mL锥形瓶，180 r/min、37℃培养12 h，得种子液。种子液按5%体积比接种到验证培养基，装液量100 mL/250 mL锥形瓶，200 r/min、37℃培养12 h后降温至25℃培养24 h。取发酵上清液，测定β-甘露聚糖酶活性[7]。

　　2结果与分析

　　2.1枯草芽孢杆菌M2的抗生素耐受性测定

　　菌株M2对不同抗生素的耐受性差异较大（见表1）。其中，对红霉素的耐受浓度高达1 000μg/mL以上，对链霉素的耐受浓度约200μg/mL，对四环素等的耐受浓度约10μg/mL，对庆大霉素等的最高耐受浓度低于5μg/mL，对克林霉素等的最高耐受浓度不到1μg/mL。

　　根据菌株M2对抗生素的耐受性实验结果，分别保藏耐受200μg/mL链霉素、2μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素、1μg/mL新霉素、0.5μg/mL克林霉素、2μg/mL卡那霉素、4μg/mL巴龙霉素、30μg/mL氯霉素、0.3μg/mL夫西地酸、0.2μg/mL利福平的培养物，作为后续突变株筛选的起始菌株。

　　红霉素浓度高达1 500μg/mL时，菌株生长完全不受抑制，说明菌株对红霉素不敏感，难以引入核糖体耐药性突变。因此，不将红霉素作为抗性突变株筛选用抗生素。

　　2.2抗性突变株的初筛

　　2.2.1链霉素抗性突变株的初筛

　　取起始菌种悬液涂布于含200、225、250μg/mL链霉素的LB平板上，37℃培养24h。在含200μg/mL链霉素的LB平板上共筛选得到26株突变株。经产酶活性初筛，得到3株活性较好的遗传稳定菌株，分别为Str2、Str11、Str25（见表2）。

　　2.2.3克林霉素抗性突变株的初筛

　　取起始菌种悬液涂布于含0.5、0.75、1μg/mL克林霉素的LB平板上，37℃培养24 h。在含0.5、0.75μg/mL克林霉素的LB平板上共筛选得到22株突变株。经产酶活性初筛，得到1株活性较好的遗传稳定菌株Cli14（见表4）。

　　2.2.7利福平抗性突变株的初筛

　　取起始菌种悬液涂布于含0.2、0.25、0.3μg/mL利福平的LB平板上，37℃培养24h。在含0.2、0.3μg/mL利福平的LB平板上共筛选得到37株突变株。经产酶活性初筛，得到6株活性较好的遗传稳定菌株Rif1、Rif7、Rif15、Rif23、Rif29、Rif31（见表8）。

　　3结语

　　本文测定Prs过表达重组β-甘露聚糖酶生产菌株枯草芽孢杆菌M2对靶向核糖体的11种抗生素的耐受谱，对以枯草芽孢杆菌为底盘细胞的重组菌核糖体工程诱变有实际参考价值。

　　通过对抗性突变株的初筛，得到17株产酶量较高的菌株。经发酵液酶活验证，显示3株抗性突变株（Par5、Gen17、Gen3）的发酵液酶活较原始菌株均提高约20%，1株（Str25）的酶活较原始菌株提高29.90%，达6 516 U/mL。

　　本文所得4株高产抗性突变株，由巴龙霉素、庆大霉素和链霉素诱变产生，揭示在菌株中引入不同的抗生素突变能有效提高次级代谢产物产量。复合抗生素的使用较单一抗生素有更显著的效果，并在产量提升上具有“叠加效应”。诱导联合耐药突变还可产生高频阳性突变[8]。后续可考虑将上述3种抗生素组合，对高产酶突变株进行复合诱变，以得到酶产量更高的突变株。

参考文献

　　［1］陈骁昱,吴忧,雷佳乐,等.核糖体工程技术选育优质菌株的研究进展［J］.发酵科技通讯,2022,51(3):169-175.

　　［2］BHAT M.Cellulases and related enzymes in biotechnology［J］.Biotechnology Advances,2000,18(5):355-383.

　　［3］熊进,黄魁英,夏枫耿,等.耐高温β-甘露聚糖酶毕赤酵母菌M27-8发酵条件优化［J］.中国饲料,2017(19):13-16,20.

　　［4］XU L Y,ZHANG Y Y,DONG Y H,et al.Enhanced extracellularβ-mannanase production by overexpressing PrsA lipoprotein in Bacillus subtilis and optimizing culture conditions［J］.Journal of Basic Microbiology,2022,62(7):815-823.

　　［5］SINGH P C,NEENA P,PRINCE S,et al.Mannanases:Microbial sources,production,properties and potential biotechnological applications［J］.Applied Microbiology and Biotechnology,2012,93(5):1817-1830.

　　［6］李云程,林娟,梁燕辉,等.产甘露聚糖酶海洋微生物的筛选及酶学性质研究［J］.中国食品学报,2015,15(12):66-73.

　　［7］全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC 76).饲料添加剂β-甘露聚糖酶活力的测定分光光度法:GB/T 36861-2018［S］.北京:中国标准出版社,2018.

　　［8］薛莹莹,林福兴,别小妹,等.ARTP诱变联合抗生素抗性选育纳豆激酶高产菌株［J］.食品工业科技,2019,40(23):93-97.