摘要：文章集中研究和厚朴酚对痤疮丙酸杆菌的体外抑制作用及其作用机理。通过琼脂扩散法、微量肉汤稀释法、时间-杀菌曲线评估其抑菌活性，采用微生物黏附碳氢化合物法（MATH）、结晶紫染色法、溴化噻唑蓝四氮唑（MTT）法分析和厚朴酚对痤疮丙酸杆菌表面疏水性、生物膜形成情况及代谢活性的影响，借助扫描电镜（SEM）观察菌体形态结构变化。结果显示，和厚朴酚对痤疮丙酸杆菌具有显著抑制作用，且与药物质量浓度呈正相关，最低抑菌质量浓度（MIC）和最低杀菌质量浓度（MBC）分别为15.63μg/mL、31.25μg/mL，在MIC及以上浓度，能在56 h内完全抑制细菌生长。多维度实验揭示，和厚朴酚可能通过影响细菌表面疏水性、抑制细菌生物膜形成及破坏细胞完整性等途径发挥抑菌作用。实验结果表明，和厚朴酚对痤疮丙酸杆菌呈现多靶点抑菌效应，可为防治痤疮的天然抗菌剂的开发提供参考。

　　关键词：和厚朴酚；痤疮丙酸杆菌；体外抑制作用；抑菌机理

　　痤疮是一种累及毛囊皮脂腺组织的慢性炎症性皮肤病，主要表现为炎性丘疹、脓疱、结节、囊肿等皮肤损害，在青少年群体中尤为常见。由于其持久性强、难消除，且易反复，患者常常会承受较大的心理压力[1]。目前主流观点认为，痤疮丙酸杆菌（C.acnes）是导致痤疮形成的核心因素之一。其过度繁殖会分泌多种胞外水解酶（如酯酶、蛋白酶及透明质酸酶等），催化皮脂成分生化分解，触发毛囊壁炎症反应，引起痤疮的发生与发展[2]。外用抗菌药物是常见的痤疮治疗手段，包括红霉素、克林霉素、过氧化苯甲酰等[3]。然而，随着耐药性菌株持续增加，且传统抗生素存在致敏性、副作用、环境污染等问题[4]，新型抗菌药物亟待开发。

　　植物源活性物质是药物开发的宝贵来源，具有温和低毒、不易产生耐药性等优点，研究价值显著。和厚朴酚（Honokiol）作为我国传统中药厚朴的有效成分之一，不仅表现出了广谱抗菌活性，还具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理特性，符合理想抗菌剂生物安全性高、耐药性风险低的特点[5]。本文探索了和厚朴酚对C.acnes的体外抑菌活性及其对C.acnes疏水性、生物膜、形态结构的影响，为痤疮临床治疗或日化祛痘用品配制提供了新思路。

　　1实验部分

　　1.1主要材料、试剂与仪器

　　痤疮丙酸杆菌ATCC11827，购自广东省微生物菌种保藏中心；强化梭菌琼脂（RCA）、硫乙醇酸盐流体培养基（FTM），购自青岛海博生物科技有限公司；和厚朴酚，购自陕西金康泰生物科技有限公司；十六烷，购自国药集团化学试剂有限公司；0.1%结晶紫染液，购自比克曼生物科技有限公司；溴化噻唑蓝四氮唑，购自上海麦克林生化科技股份有限公司。

　　PMK224ZH分析天平，购自奥豪斯仪器（常州）有限公司；AC2-5S8-NS生物安全柜，购自新加坡艺思高科技有限公司；SPX-150BSH-Ⅱ生化培养箱，购自上海新苗医疗器械制造有限公司；UV-26001紫外分光光度计，购自岛津仪器（苏州）有限公司；Synergy多功能酶标仪，购自美国伯腾仪器有限公司。

　　1.2实验方法

　　1.2.1抑菌圈测定

　　采用琼脂扩散法，参照CLSI-M02标准，配制0.5麦氏浊度菌悬液（约1.5×108 CFU/mL）。和厚朴酚用DMSO配制成0.1、1、10 mg/mL药液。用无菌棉签均匀涂布菌液于琼脂平板，打孔后分别加入60μL不同质量浓度药液（对照组加等量DMSO），设3个平行组。37℃厌氧培养48 h后，评价抑菌功效：抑菌圈直径<10 mm表示无效；抑菌圈直径10～15 mm表示低效；抑菌圈直径15～20 mm表示中效；抑菌圈直径>20 mm表示高效。

　　1.2.2最低抑菌质量浓度（MIC）、最低杀菌质量浓度（MBC）测定

　　采用微量肉汤稀释法，参照CLSI-M07标准，将和厚朴酚配制为12.5 mg/mL的储备液，2倍稀释10个梯度。96孔板中，第1～10孔依次加入1μL梯度药液和99μL培养基，药物质量浓度从左至右递减；第11孔（阳性对照）、第12孔（阴性对照）分别加入100μL和200μL培养基；第1～11孔补加100μL菌液（1.5×106 CFU/mL），设4组平行。37℃厌氧培养48 h后读取MIC。分别取MIC、2 MIC、4 MIC孔培养液接种于RCA平板，厌氧培养96 h后读取MBC，设3个平行组。

　　1.2.3绘制时间-杀菌曲线

　　向无菌三角瓶中加入99.5 mL菌液（1.5×106 CFU/mL）与0.5 mL药液，最终药液质量浓度分别为2 MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC；对照组加入0.5 mL DMSO，设3组平行。37℃厌氧孵育56 h，每隔4 h测定菌液在600 nm处的吸光度，绘制C.acnes在56 h内的生长曲线。

　　1.2.4表面疏水性测定

　　通过MATH法测定表面疏水率。向培养管中加入3.98 mL菌液（OD600=0.5）与20μL药液，最终药液质量浓度分别为2 MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC；对照组加入20μL DMSO，设4个平行组。37℃水浴15 min后加入400μL十六烷，振荡60 s，静置15 min分层。测定水相于600 nm处的吸光度，表面疏水率=（初始OD600-加十六烷后OD600）/初始OD600×100%。

　　1.2.5生物膜形成量分析

　　采用结晶紫染色法分析生物膜形成量。6孔板中，每孔加入3.98 mL菌液（1.5×106 CFU/mL）和20μL药液，最终药液质量浓度分别为2 MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC；对照组加入20μL DMSO，设3个平行组。37℃厌氧培养96 h后，PBS漂洗3次，0.1%结晶紫染色20 min。经PBS清洗，加入4 mL 95%乙醇溶解，测定570 nm处的吸光度。

　　1.2.6生物膜代谢活性检测

　　采用MTT法检测生物膜代谢活性。96孔板中，每孔加入199μL菌液（1.5×106 CFU/mL）和1μL药液，最终药液质量浓度分别为2 MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC；对照组加入1μL DMSO，设3组平行。37℃厌氧培养96 h后，PBS漂洗3次，加入5 mg/mL MTT溶液20μL避光孵育4 h，去上清，加100μL DMSO溶解，测定490 nm处的吸光度。

　　1.2.7扫描电镜观察菌体形态

　　向培养管加入3.98 mL菌液（1.5×108 CFU/mL）和20μL药液，最终药液质量浓度为MIC；对照组加入20μL DMSO，设3组平行。37℃厌氧培养24 h后，离心收集菌体，经PBS漂洗、2.5%戊二醛固定、乙醇梯度脱水后借助电镜观察。

　　1.2.8统计学分析

　　采用SPSS27.0软件对数据进行统计分析。数据以mean±SD表示，不同组间采用单因素方差分析法（P<0.05表示差异有统计学意义）进行两两比较。利用Prism10.1.2软件进行绘图处理。

　　2结果与讨论

　　2.1抑菌圈测定结果

　　琼脂扩散法测定结果显示，和厚朴酚在10 mg/mL和1 mg/mL的质量浓度下对C.acnes的抑菌圈直径分别达到了48.83 mm和38.23 mm，表现出了高效抑菌作用；在0.1 mg/mL质量浓度下无抑菌圈生成。可见，和厚朴酚对C.acnes具有抑制作用，且其抑菌活性与药物质量浓度呈正相关。

　　2.2 MIC、MBC测定结果

　　微量肉汤稀释法测定结果显示，和厚朴酚对C.acnes的MIC、MBC分别为15.63μg/mL、31.25μg/mL。可见，和厚朴酚能抑制C.acnes生长发育，在较低质量浓度下即可达到杀菌效果。

　　2.3时间-杀菌曲线

　　研究发现，对照组细菌长势良好，经和厚朴酚处理，细菌生长曲线表现滞后（见图1）。在2 MIC、MIC质量浓度下，各组菌液吸光度随时间增加持续处于初始水平，表明和厚朴酚能完全抑制细菌生长；在1/2 MIC、1/4 MIC质量浓度下，各组细菌生长缓慢，迟缓期持续延长，细菌进入对数期较慢。结果表明，和厚朴酚能抑制C.acnes生长繁殖，干扰菌体代谢周期，且其抑制效果与药物质量浓度呈正相关。

　　2.5和厚朴酚对痤疮丙酸杆菌生物膜的影响

　　结果显示，经和厚朴酚作用，细菌生物膜形成量（OD570）、生物膜代谢活性（OD490）明显降低，且随着药物质量浓度增加呈下降趋势，组间差异显著（P<0.05）。结果表明，和厚朴酚能显著抑制C.acnes生物膜形成并有效减少膜内活菌数量（见图2）。这种基于生物膜的抑菌机制，可有效阻断细菌在毛囊皮脂腺单位定植扩散。

　　3结语

　　本文探究了和厚朴酚对痤疮丙酸杆菌的体外抑制作用及其作用机理。结果显示，和厚朴酚不仅对C.acnes具有显著的抑菌活性，还可影响C.acnes的表层疏水性、生物膜及细胞形态结构。其主要作用机理可能涉及改变细胞膜通透性、抑制或破坏细菌生物膜体系、削弱细菌黏附能力等，但其作用的特异性分子靶点仍有待深入探索。研究表明，和厚朴酚作为植物源活性物具备多靶点抑菌特性，具有开发为新型天然抗菌剂的潜力。

参考文献

　　［1］EICHENFIELD D Z,SPRAGUE J,EICHENFIELD L F.Management of acne vulgaris:A review［J］.JAMA,2021,326(20):2055.

　　［2］MAYSLICH C,GRANGE P A,DUPIN N.Cutibacterium acnes as an opportunistic pathogen:An update of its virulence-associated factors［J］.Microorganisms,2021,9(2):303.

　　［3］鞠强.中国痤疮治疗指南(2019修订版)［J］.临床皮肤科杂志,2019,48(9):583-588.

　　［4］犹忠萍,曹碧兰.痤疮丙酸杆菌抗生素耐药性研究进展［J］.中国皮肤性病学杂志,2018,32(12):1459-1463.

　　［5］PAN C,LI Q,XIONG S,et al.Delivery strategies,structural modification,and pharmacological mechanisms of Honokiol:A comprehensive review［J］.Chemistry&Biodiversity,2024,21(6):e202302032.

　　［6］MAZUMDER S,FALKINHAM J O,DIETRICH A M,et al.Role of hydrophobicity in bacterial adherence to carbon nanostructures and biofilm formation［J］.Biofouling,2010,26(3):333-339.