摘要：该文为监测安徽某规模化奶牛场奶牛乳房炎无乳链球菌的流行情况及其携带的毒力基因，采集该牛场患牛乳样，进行细菌分离培养和PCR鉴定，并进行同源性比较。结果显示，分离株为无乳链球菌，并携带neuC、cfb、cpsM 3种毒力基因。研究结果表明，引起该奶牛乳房炎的主要致病菌为无乳链球菌，为该牛场养殖管理和疾病防控提供基础理论依据。

　　关键词：乳房炎；链球菌；毒力基因

　　0引言

　　无乳链球菌是引起奶牛乳房炎主要的病菌之一，属于革兰氏阳性链球菌，在血琼脂平板上形成表面光滑、有β溶血环的灰白色圆形菌落。奶牛感染无乳链球菌后乳房出现炎症表现，乳汁变性，泌乳量减少或者停止。1887年，首次分离出无乳链球菌，并确定其为奶牛乳房炎的病因之一。在饲养条件较差的奶牛场易出现感染传播，造成巨大的经济损失。据报道，我国每年有20%～40%的奶牛乳房炎是由无乳链球菌引起的。本试验针对牛源无乳链球菌进行快速分离鉴定，并分析其毒力基因，为明确无乳链球菌的致病力、相关致病机制及后续的疾病防控提供科学依据。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1病料来源

　　安徽某奶牛场患乳房炎奶牛乳样。

　　1.1.2主要试剂

　　哥伦比亚血琼脂培养基、营养肉汤培养液、引物、Taq酶、DNA marker、去离子水、琼脂糖等均由实验室保存。

　　1.2方法

　　1.2.1细菌的分离培养与基因组提取

　　混匀乳样离心后，取上清液涂布于哥伦比亚血琼培养基，37℃培养24 h。挑取灰白伴溶血环疑似菌落于新培养基37℃纯化培养。取纯化单菌落至肉汤中，37℃培养。取适量菌落加入双蒸水（xx水）混匀，煮沸后冷却离心，取上清液保存备用。

　　1.2.2引物的设计与合成

　　以无乳链球菌的全部基因组DNA为模板设计引物并合成。

　　1.2.3毒力基因的检测

　　设计合成引物，PCR扩增，扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序结果于NCBI网站中进行Blast序列比对，比对结果见表1。

　　2结果

　　2.1形态学鉴定结果

　　利用哥伦比亚血琼脂培养基进行纯化培养，可见菌落形态呈灰白色表面光滑的圆形，部分菌落有溶血环，见图1A。革兰氏染色结果为阳性，镜检细菌呈单个球状或长链状，见图1B。

　　2.2 16S rRNA基因鉴定和系统进化树

　　将提取出的菌株基因组送由上海生工生物公司测序，结果与GenBank数据库中的序列进行同源性分析比对，发现1株分离菌（图2中红框标注部分）与已发表无乳链球菌匹配程度为51%，由此确定此株细菌为无乳链球菌，并构建系统发育进化树，见图2。

　　2.3毒力基因检测结果

　　由图3可知，对分离出的牛源无乳链球菌进行scpB、neuC、cfb、cpsM、srtC、cpsA、gbs0628、pavA、sugA、nevA、psaA 11种毒力基因的PCR检测，有neuC、cfb、cpsM毒力基因被检出，其余毒力基因尚未被检出。

　　3讨论

　　奶牛乳房炎是全球养牛业危害最大的一类疾病之一，引发奶牛发生乳房炎的细菌种类繁多，其中链球菌是最常见的一类细菌。在奶牛感染无乳链球菌后会出现慢性乳房炎症，产奶量逐渐下降，产出的乳带有絮状物，乳房逐步萎缩，严重影响养殖场经济效益。本试验利用哥伦比亚血琼脂平板对采集的奶样进行初步分离纯化，并得到灰白色带有溶血环的菌株，基于16S rRNA基因的测序比对，确定此次分离的为无乳链球菌。

　　对无乳链球菌进行毒力基因PCR鉴定，仅发现有neuC、cfb、cpsM 3种毒力基因被检出。前人发现cfb毒力基因检出率相对较高，而neuC和cpsM毒力基因检出率相对较低。这是因为CAMP因子可以使无乳链球菌产生很高的特异性，可形成伞状的透明溶血区域。临床上CAMP试验被广泛的用作实验室无乳链球菌鉴定试验；国内的研究显示几乎所有的无乳链球菌都能检测出CAMP因子的编码基因cfb，因而cfb毒力因子的检测率相对较高。试验检测出neuC和cpsM毒力基因，但国内检测结果显示目前neuC毒力基因仅在2型猪链球菌感染中被发现。cpsM毒力基因的在前人的试验中也少有检出。

　　奶牛感染无乳链球菌是造成乳房炎的重要原因之一，毒力基因的检测是确定致病强弱的重要依据，通过对分离出的牛源无乳链球菌进行毒力基因的PCR检测，有neuC、cfb、cpsM毒力基因被检出，为牛源无乳链球菌感染提供诊断依据。

　    参考文献：

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