摘要：时间分辨荧光免疫分析技术（Time-resolvedfluorescence immunoassay.TRFIA）是一种以镧系元素或其微球作为标记物，测量标记物所发射荧光标记分析技术，其特点是灵敏度高且无放射性污染[1]。由于TRFIA技术有着传统方法所不具备的检测成本低，检测速度快等诸多优势，因此TRFIA技术为牦牛肉质安全检测开辟一条崭新的检测途径。该文就TRFIA技术及其在牦牛肉质安全检测应用进展做一简要综述。

　　关键词：时间分辨荧光免疫分析技术；牦牛肉；安全检测；兽药残留

　　0引言

　　我国牦牛主要养殖区在青藏高原及其周边部分地区，在青海牦牛养殖主要分布在玉树藏族自治州，黄南藏族自治州，海北藏族自治州等少数民族自治州的农牧区。随着牦牛养殖业的发展进步以及国内外消费者对牦牛肉制品的青睐牦牛的养殖规模及其所产生的经济效益的正在不断的扩大，牦牛养殖逐渐成为青海地区特有的优势产业[2-3]。如今牦牛养殖产业正在不断的扩大，但随之而来的是养殖过程中存在的问题不断显现。对牦牛肉制品的安全检测是防止存在问题的牦牛肉制品流入市场的关键环节。传统畜牧兽药检测方法包括酶免疫分析法（Enzyme Immunoassay，简称EIA）[4]、荧光免疫分析法(fluorescence Immunoassay，FIA）[5]、胶体金免疫分析法（Immune Colloidal Gold Technique，CGIA）[6]、微生物学分析法[7]、气相色谱法（Gaschromatography，GC）[8]、高压-液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[9]、色谱-质谱联用法[10]等多种检测方法，这些传统方法都伴随着复杂繁琐的前处理过程，这不仅增加了检测难度，还可能导致检测效率低下，费时费力。同时也存在试剂、仪器价格昂贵，体积庞大等缺点，这些检测方法虽然具有高精确度和准确度的优点，但是难以满足牦牛肉高通量，快速检测等问题的需求。目前以时间分辨荧光免疫分析技（TRFIA）为核心所研发的快速检测卡是近些年新兴的一种对畜牧产品中兽药残留检测的方法。与其他检测方法相比其具有体积小、携带方便、检验操作流程简单、检测成本低等诸多优点。经过实验人员大量实验证明依据TRFIA方法所研制的快速检测卡的检测结果在所测标准质控样品的标准值范围内，检测结果与传统的高精度方法检测结果对比一致性较高，该方法的准确度和精确度满足使用要求[10]。

　　1时间分辨荧光免疫分析技术检测法

　　1.1时间分辨荧光免疫分析技术概述

　　时间分辨荧光免疫分析技术（TRFIA）是以镧系元素（包括Eu、Tb、Sm、Dy等）或其微球作为标记物，代替传统的荧光物质，酶，同位素，抗原等传统标记物，综合免疫反应的高特异性和镧系元素标记的高灵敏性而建立的一种新型非放射性免疫检测技术。镧系元素具有斯托克斯（Stokes）位移较大（大于200 nm）以及荧光寿命较长（为1～2 ms）的优点，这种优点可以有效避免激发光及背景荧光信号的干扰，显著提升了检测灵敏度[1-2]。就灵敏度而言，时间分辨荧光免疫技术远高于传统的色谱-质谱联用法、胶体金免疫分析法等传统检测方法。鉴于其上述特点，TRFIA已广泛应用于医学临床检验如乙型肝炎相关病毒感染患者的检验[11]，兽医临床诊断以及食品安全检测等多个生物学相关领域。

　　1.2时间分辨荧光免疫分析技术原理

　　时间分辨荧光免疫分析技术在对牦牛肉进行检测的应用中是以时间分辨荧光微球（羧基化铕微球）作为荧光物质标记抗体，针对牦牛肉样品中目标检测因子建立荧光免疫层析检测方法。使用与之配套的分析仪器读取固定测试区（T）线与控制区（C）线位置的荧光强度并计算二者比值（T/C），通过荧光定量快速检测仪内置的标准曲线即可快速计算出所检测的样品中标靶物质的浓度[15，17，20，23]。

　　1.3时间分辨荧光免疫分析技术分析系统

　　时间分辨荧光免疫层析快速检测卡是以时间分辨荧光免疫分析技术为核心技术所研发的最新型检测方法，其具备标记物制备简单，存储时间长，操作便捷、可重复性强等优点。结合和与之配套的优化后的荧光定量快速检测仪可实现牦牛肉制品中兽药残留的随时检测、快速检测、重复检测。荧光定量快速检测仪内部内置数据传输系统配合为检验所搭建的检测数据自动采集系统可实现自动汇总各实验室的采集的数据，自动完成对各实验室的检测数据的收集，按照检测单位、地区、种类、产地、检测项目、生产单位、月份和年份等全流程要素进行实时动态的统计归类和制作报表，自动对检测数据进行筛查和提醒，将检测数据的通过动态传输系统，报存于检测数据库，在现有基础上搭建检测应用接口，从而实现从生产控制、试验室分析到管理决策等多方面要素的有机结合，极大缩短了时间成本和经济成本，具有较高的科学研究价值和实际应用价值[12]。

　　2牦牛肉中兽药残留检测的应用

　　时间分辨荧光免疫层析快速检测卡含有被事先固定于硝酸纤维素膜（NC膜）反应区（T）的抗原和质控区（C）的二抗以及固定于底板上的荧光染料组成。在层析过程中试样中含有的磺胺类药物、四环素类药物，阿维菌素类药物等与NC膜上预包被的抗原竞争游离的金标抗体，反应区（T）聚集的金颗粒可显著猝灭该处荧光，猝灭程度和样品中的磺胺类药物、四环素类药物，阿维菌素类药物等药物浓度成反比。根据反应区（T）及检测卡反应区（T），质控区（C）之间空白区荧光强度计算牦牛肉制品中磺胺类药物、四环素类药物，阿维菌素类药物等药物的含量。

　　2.1阿维菌素时间分辨荧光免疫层析快速检测卡的研制

　　阿维菌素是由日本和美国生物制药公司首先联合开发的具有杀虫、杀螨等功能的十六元大环内酯类化合物，其主要产自于阿维菌素链霉菌的发酵过程，阿维菌素对牦牛饲养过程中出现的各类寄生虫同样具有高效的驱杀作用，因此也是目前牦牛饲养过程中普遍使用的抗寄生虫类药物之一[13]。阿维菌素具有较高的脂溶性，在动物体内残留时间长，在药理学上其具有神经和发育毒性，因此阿维菌素被列为高毒性化合物品类[14]。根据2021年发布的《食品安全国家标准食品中农药最大残留量》阿维菌素药物在牦牛肌肉组织中的最大残余量为100μg/kg[15]。快速检测卡以羧基化铕微球作为荧光标记物与阿维菌素鼠单克隆抗体G10703进行共价偶联后喷涂于释放垫上。制作免疫层析试纸条的过程：阿维菌素抗原包被于硝酸纤维素膜上作为检测线（T），将羊抗鼠免疫球蛋白包被于硝酸纤维素膜上作为质控线（C）。经实验室验证阿维菌素时间分辨免疫层析快速检测卡的灵敏度为1.0μg/kg、准确度为86.9%～105.2%，精密度为7.5%～11.2%。方法学比较：使用阿维菌素添加量分别为1、2、4μg/kg的牦牛肉作为实验样本，同时使用以TFRIA技术为基础的快速检测卡与国标LC-MS/MS方法进行试验对比，将使用2种方法所得的实验数据进行相关性分析，2种实验方法所得结果的线性方程：y=0.938x+0.110（R2=0.9615），结果表明二者呈现明显的线形关系[16]。程林丽等[17]研究者使用高效液相色谱法对牛奶中的阿维菌素类药物进行测定，检测结果2～100μg/kg的添加量平均的回收率在70.2%～119.5%区间内，变异系数在1.5%～18.9%的区间范围内。经对比分析综合指标与传统检验方法相当。

　　2.2四环素类荧光定量快速检测卡的研制

　　四环素是一种广谱抗生素，常用作牦牛养殖过程中预防和治疗细菌感染性疾病的兽药[18]。根据2021年发布的《食品安全国家标准食品中农药最大残留量》四环素类药物在牦牛肌肉组织中的最大残余量为200μg/kg[15]。四环素类TRFIA快速检测卡的检测定量限为10 ug/kg，添加平均回收率在80.0%～120.0%范围内，平均RSD值为11%～15%范围内，四环素检出限为10μg/kg，定量范围为10～80μg/kg。该方法可在30 min内完成样本的前处理，10 min左右完成样本的定量检测。方法学比较：分别采用时间分辨荧光免疫层析定量分析法为核心的快速检测卡和GB/T 21317—2007《动物源性食品中四环素类兽药残留检测方法》中所规定的液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS法）对相同添加浓度的实验样本进行测验，将2种不同检测手段的结果进行一致性对比，分析结果得出分别采用2种检测方法对同一添加浓度的实验样本进行检测所得结果一致性较高[19]。

　　2.3磺胺类荧光定量快速检测卡的研制

　　磺胺类药物是人工合成的抗菌类药物，其是以氨基苯磺酰胺为基本结构的衍生物，因其具有抗菌谱范围广、药性稳定、易吸收、价格合理，供应量充足等诸多优点而成为牦牛饲养过程中最常使用的抗感染和治疗细菌感染的药物[20]。但是在动物食品中磺胺类抗生素的代谢产物乙酰化磺胺溶解性低，容易在尿液中析出结晶不容易排出体外，长期堆积容易造成泌尿系统毒性，易产生极性溶血性贫血和消化系统紊乱等不良反应，严重影响身体健康[21]。根据2021年发布的《食品安全国家标准食品中农药最大残留量》磺胺类药物在牦牛肌肉组织中的最大残余量为100μg/kg[15]。本方法对牦牛肉中磺胺类药物的检测限为小于2.00μg/kg。检测样本的添加回收率在90%～115%，批内的离散系数都低于10%、批间的离散系数都低于13%。方法学比较：使用磺胺类荧光定量快速检测卡与国标液相色谱-质谱法对20份牦牛肉样品进行测定，对2种检测方法所得测定数据进行一致性分析，结果显示本法和标准法符合率为100%[22]。

　　2.4喹诺酮类荧光定量快速检测卡的研制

　　喹诺酮类（Quinolones）药物是人工合成的一抗菌类物，这类药物因拥有抗菌谱范围广、杀菌力强、作用迅速、低毒等优点而被应用于牦牛养殖过程中的病毒类疾病的预防和治疗[23]。根据2021年发布的《食品安全国家标准食品中农药最大残留量》允许使用的喹诺酮类药物包括达氟沙星（Danofloxacin）又名单诺沙星、二氟沙星（difloxacin）、恩诺沙星（含环丙沙星）、噁喹酸（Oxilinic acid）、沙拉沙星（Sarafloxacin）这5种药物，在牦牛肌肉组织中最大残余量分别为200、400、100、100、10 mg/kg[15]。《中华人民共和国农业部公告第2292号》规定中《兽药管理条例》第六十九条规定，在畜牧饲养及动物食品中禁止使用洛美沙星（lomefloxacin）、培氟沙星（Pefloxacin）、氧氟沙星（Oflox ac in）、诺氟沙星（Norflo x ac in）等4种兽药[24]。使用喹诺酮类荧光定量快速检测卡对牦牛肉中喹诺酮类药物的检测限为氧氟沙星1μg/kg，洛美沙星1.11 g/kg，培氟沙星0.62μg/kg，恩诺沙星0.625μg/kg，环丙沙星0.5μg/kg，检测范围在0～4μg/kg区间内，批内添加回收率在82.94%～111.27%，变异系数在4.13%～9.90%，批间回收率在88.86%～107.05%，变异系数在3.86%～9.39%区间内，方法学比较：用本方法与仪器法对20份添加环丙沙星药物的牦牛肉样品盲样进行检测比较，所使用的传统方法采用国标法中所规定的液相色谱-质谱法，依据为GB/T 21312—2007《动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法》。应用本方法对20份牦牛肉样品进行检测结果为各水平样本的回收率在89.88%～114.13%区间范围内，各水平实验样本批内变异系数都低于10%、批间变异系数皆低于15%，根据2种检测方法所得结果结果建立的线性方程为：Y=0.955x+0.039，决定系数为R2=0.978。龙启萍等研究者应用超高效液相色谱-质谱串联法对牦牛肉中的11种喹诺酮类药物进行检测，牦牛肉样品中药物添加浓度在1.5～10.0μg/kg时，11种喹诺酮药物在牦牛肉中的平均回收率为84.2%～97.7%，RSD为5.2%～12.1%，在2.5～100.0μg/L范围内线性良好。根据结果对比分析显示本方法与传统方法检测结果符合率接近100%。

　　2.5莱克多巴胺荧光定量快速检测卡的研制

　　莱克多巴胺（Ractopamine，RAC）是一种人工合成的β-肾上腺受体激动剂（别名β-兴奋剂）类的化合物。这类物质在畜牧饲养的过程中进入其体内可以抑制脂肪的形成，促进骨骼肌蛋白质的合成进而提高畜牧的“瘦肉率”，莱克多巴胺也就是俗称的“瘦肉精”。根据农业部最新文件《农业部公告禁用兽药目录汇总》中指出莱克多巴胺在动物源性食品中不得检出。莱克多巴胺荧光定量快速检测卡的定量限为0.5μg/kg，回收率在90.94%～111.40%，进行精确度检验结果为各添加浓度的批内变异系数低于10%、批间变异系数均低于15%。用此方法与仪器法对20份牦牛肉样本盲样进行检测比较，其中仪器方法采用2008年农业部公布的国标法，依据为GB/T 22286—2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》。检测结果莱克多巴胺荧光定量快速检测法检测牦牛肉定量限为0.5μg/kg，所有样品加标回收率都在90.94%～111.40%。各浓度实验样本样本的批内变异系数皆低于10%、各实验样本的批间变异系数低于15%。通过对2种实验方法所得结果对比分析本法与仪器法符合率为100%。

　　3总结

　　以TRFIA技术为核心所研发的快速检测试剂盒有操作简便、成本低、易于实现牦牛肉中兽药残留快速准确检测等特点，搭配与之配套的检测数据自动采集系统再结合物联网、云计算、大数据和地理信息等技术，通过感知设备、通讯网络、二维码等设备技术，实现信息融合、查询、监控，实现牦牛肉制产品的源头、加工、流通、消费等信息的全程可追溯，打造安全健康的牦牛肉产品。随着各大科研机构和科研工作者对TRFIA技术的重视及不断深入的研究，这项技术在牦牛肉质安全检测方面的应用取得突破性进展。TRFIA技术不仅为牦牛制品从饲养，屠宰到加工整个生产流程提供快捷有效的质量监控，同时也为维护消费者的健康和权益提供技术保障，拥有较高的科研价值和应用价值。

　　参考文献

　　[1]Niu C G，Liu J，Qin，P.Z，et al．A novel bifunctional europium chelate applied in quantitative determination of human immunoglobin G using time-resolved fluoroimmunoassay[J].Analytical biochemistry，2011，409（2）：244-248.

　　[2]沈健，林德球，徐杰．时间分辨荧光免疫分析技术研究现状及进展[J]．生命科学，2004（1）：55-59.

　　[3]张越杰，王芳．我国牦牛市场与产业调查分析报告[J]．农产品市场，2021（23）：54-55.

　　[4]Porstmann T，Kiessig S T．Enzyme immunoassay techniques an overview[J]．Journal of immunological methods，1992，150（1-2）：5-21.

　　[5]HemmiläI．Fluoroimmunoassays and immunofluorometric assays[J]．Clinical chemistry，1985，31（3）：359-370.

　　[6]Wang S，Quan Y，Lee N，et al．Rapid determination of fumonisin B1 in food samples by enzyme-linked immunosorbent assay and colloidal gold immunoassay[J]．Journal of agricultural and food chemistry，2006，54（7）：2 491-2 495.

　　[7]Van Der Zee H，Huis In T Veld J H．Rapid and alternative screening methods for microbiological analysis[J]．Journal of AOAC International，1997，80（4）：934-940.

　　[8]Blomberg J，Schoenmakers P J，Brinkman U T．Gas chromatographic methods for oil analysis[J]．Journal of Chromatography A，2002，972（2）：137-173.

　　[9]Brown P．High Pressure Liquid Chromatography：Biochemical and Biomedical Applications[J]．Elsevier，2012.

　　[10]MaštovskáK，Lehotay S J．Practical approaches to fast gas chromatography–mass spectrometry[J]．Journal of Chromatography A，2003，1000（1-2）：153-180.

　　[11]梁荣良．基于时间分辨荧光微球的免疫分析技术平台的建立及临床应用[D]．广州：南方医科大学，2018.

　　[12]任冰强，黄立华，黄惠杰．基于免疫层析技术的时间分辨荧光免疫分析仪研究[J]．仪器仪表学报，2009（6）：1 330-1 335.

　　[13]于童．乙酰氨基阿维菌素在牦牛体内的药物动力学、残留消除规律及药效学研究[D]．北京：中国农业大学，2015.

　　[14]陈静，罗永煌．阿维菌素类药物在动物性食品中的残留检测研究概况[J]．贵州畜牧兽医，2007（4）：9-11.

　　[15]GB/T 2763-2021．食品安全国家标准食品中农药最大残留限量[S]．中华人民共和国国家卫生健康委员会，中华人民共和国农业农村部，国家市场监督管理总局，2021.

　　[16]张正英，崔乃元，高海燕，等．牦牛肉中阿维菌素残留的时间分辨荧光免疫层析检测方法的建立[J]．肉类研究，2020（8）：57-62.

　　[17]程林丽，安洪泽，沈建忠，等．牛奶中4种阿维菌素类药物的高效液相色谱快速测定[J]．中国农业大学学报，2010，15（4）：95-98.

　　[18]李伟明，鲍艳宇，周启星．四环素类抗生素降解途径及其主要降解产物研究进展[J]．应用生态学报，2012（8）：2 300-2 308.

　　[19]张正英，崔乃元，王云平，等．青海牦牛肉中四环素药物残留时间分辨荧光免疫层析测定方法的研究[J]．兽医导刊，2021（15）：135-136.

　　[20]李云开，刘世荣，张克强，等．磺胺类药物在农田生态系统中迁移转化过程的研究进展[J]．中国畜牧兽医，2007（12）：141-144.

　　[21]庞雅君，刘伟，张继东，等．磺胺类药物的临床应用及注意事项[J]．畜牧兽医科技信息，2008（3），92-93.

　　[22]黄文颖，张沛，赵维章，等．时间分辨荧光免疫层析法检测青海牦牛肉中磺胺类药物残留[J]．分析试验室，2023（11）：1 489-1 493.

　　[23]施杏芬，陆国林．兽用喹诺酮类药物残留的危害及对策[J].中国动物检疫，2008（9）：16-17.

　　[24]中国动物保健[S]．中华人民共和国农业部公告，2015（10）：90.