摘要：肺炎克雷伯菌作为导致奶牛患乳房炎主要病原菌之一，导致奶牛产奶量下降和乳品质量降低。为保证奶牛养殖业健康发展，减少乳制品行业的经济损失。该研究通过细菌分离鉴定和分子生物学技术，对牛源性肺炎克雷菌的分离和主要毒力因子的检测，为临床诊治和致病机理提供指导。

　　关键词：肺炎克雷伯菌；乳房炎；毒力基因

　　0引言

　　肺炎克雷伯菌是在自然界中存在广泛的一种革兰氏阴性菌，为肠杆菌科克雷伯菌属。1822年，研究人员首次从大叶性肺炎病人痰液里分离出肺炎克雷伯氏菌，之后在全世界范围内相继被报道。近年，陆续报道出该菌引起不同动物源性疾病，据报道已在兔、大熊猫、貉、貂、鹿、鸡、猪、犬、牛、羊等动物体内分离出，可引起败血症、脑膜炎等，严重时会导致患病动物死亡，因此该菌对养殖业的发展和公共卫生安全具有严重的危害。肺炎克雷伯菌是奶牛临床型乳房炎的主要病原之一。肺炎克雷伯菌是仅次于大肠杆菌的第二常见的引起奶牛临床型乳房炎的革兰氏阴性菌，但在减奶量、弃奶率、治疗成本、致死率和扑杀率方面，其危害高于大肠杆菌。本文分离鉴定了安徽蚌埠某奶牛场乳房炎乳汁样品中的肺炎克雷伯菌及其毒力因子，为相关研究提供参考。

　　1材料与方法

　　1.1试验材料

　　1.1.1样品来源

　　安徽某牛场患乳腺炎的奶牛乳汁。

　　1.1.2主要试剂

　　ddH2O；DNA提取试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司；哥伦比亚血琼脂培养基、PCR试剂购于南京全隆生物技术有限公司；相关测序由上海生工完成。

　　1.2方法

　　1.2.1病原菌分离培养

　　将所采集的奶样置于1.5 mL离心管约1.3 mL，4℃12 000 r/min离心10 min后，取上清液接种于血平板并于37℃培养16～18 h，划线法纯化细菌1～2次，挑取单菌落接种到肉汤中，采用摇箱用法37℃摇菌18～24 h。所有接种操作均在超净工作台完成。

　　1.2.2病原菌革兰氏染色镜检

　　向干净的载玻片中央滴1滴蒸馏水，将接种环在火焰上灭菌冷却后，勾取适当的病原菌使其于蒸馏水充分混合并涂成直径约1.5 cm的菌膜，在火焰上放以钟摆方式进行固定，固定好后进行染色。初染：首先将草酸铵结晶紫溶液染色1.5 min，再用蒸馏水冲洗至无染料在载玻片上。媒染；使用革兰氏碘液媒染60 s，用蒸馏水冲洗载玻片。脱色：使用95%乙醇脱色，与样本充分作用30 s。复染：最后滴加沙黄复染60 s，蒸馏水冲洗后使用吸水纸吸干或自然晾干。镜检：将干燥的载玻片置于显微镜下观察细菌的染色及形态特征。

　　1.2.3病原菌DNA模板提取与16S rRNA基因测序

　　刮取菌落于离心管含50～100μL ddH2O中，混匀煮沸10 min取出，4℃冷却5 min，12 000 r/min离心10 min，取上清。参考Gengbank和相关文献选取肺炎克雷伯菌5种毒力因子检测（表1），引物由上海生工合成。

　　1.2.4病原菌PCR测定及琼脂凝胶电泳试验

　　PCR的反应体系为25μL：DNA模板2μL，ddH2O 8.5μL，上、下各1μL，premixTag酶12.5μL；94℃预变性5 min，94℃变性30 s 30个循环，56℃退火30 s 35个循环，72℃延伸90 s 35个循环，72℃再延伸10 min。取4μL PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后进行观察。

　　2结果

　　2.1病原菌分离培养与镜检

　　牛源肺炎克雷伯菌在哥伦比亚血琼脂培养基上圆形突起，表面光滑湿润，黏稠拉丝状的灰白色菌落，见图1A。病原菌进行革兰氏染色呈两端短粗红色短杆菌，单个或成对存在，见图1B。

　　2.2琼脂凝胶电泳试验结果

　　经测序，得出vgrG毒力因子检测率最高，udg、acrA毒力因子相继次之，fimH和rffG毒力因子在本次试验中未被检出，结果与预期目标片段条带大小相符，见图2。

　　2.3 16S rRNA基因测序

　　测序后的结果在NCBI网站上选取相似度最高的序列，使用MAGA11软件采用NJ法构建系统发育树，见图3。

　　3讨论

　　肺炎克雷伯菌为人畜共患条件性致病菌，存在于动物机体多种器官组织引起多种病变。本研究从患乳房炎的奶样中分离出的菌株，再通过哥伦比亚血琼脂培养基上分离培养和革兰氏染色鉴定为肺炎克雷伯菌。利用PCR技术对其进行5种毒力因子的鉴定，结果显示检测到3种毒力因子分别为vgrG、udg、acrA，未被检出的毒力因子为fimH和rffG。基于16S rRNA基因序列进行同源性分析发现，fimH毒力因子和udg毒力因子同源性为98%，acrA毒力因子单独为一分枝，vgrG和rffg同源性为60%，肺炎克雷伯菌的致病性与毒力因子密切相关，acrA基因涉及多种化合物的耐药性；vgrG基因为Ⅵ型分泌系统尖端蛋白，它在毒力、定殖、扩散及竞争遗传有重要作用；ugd基因可能在信号传导、细胞迁移中发挥作用。根据毒力因子的检测，肺炎克雷伯菌的防治有着巨大的挑战，其致病机理和耐药性的特点还需进一步探究。

　　本研究从患乳房炎病牛乳样中分离到的肺炎克雷伯菌，对牛源性肺炎克雷伯菌的临床诊治、致病机理提供一定的研究依据及防治意义。

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