摘要：普多沙星（Pradofloxacin）是一种动物专用的新型第3代氟喹诺酮类抗菌药。普多沙星虽然为犬猫专用药物，但仍存在将其用于食品动物的可能，而动物源食品中兽药残留会损害人类的健康。因此，有必要建立快速高效的普多沙星残留检测方法。酶联免疫吸附测定法（ELISA）非常适合于抗生素药物残留的快速检测。该研究利用化学偶联方法将普多沙星与牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清蛋白（OVA）成功偶联，获得了普多沙星-BSA和普多沙星-OVA，并利用紫外—可见分光光度法对合成的免疫原进行初步鉴定分析。以人工抗原普多沙星-BSA为免疫原免疫实验兔，制备抗血清，最终建立了检测普多沙星的间接竞争ELISA方法。本方法的检测限0.023 8μg/mL，检测范围为0.023 8～4.010μg/mL。

　　关键词：普多沙星；人工抗原；多克隆抗体；ELISA

　　0引言

　　氟喹诺酮类药物（FQNs）是始于20世纪70年代并迅速发展起来的一类由人工合成的广谱抗菌药物[1]。普多沙星是第3代喹诺酮类药物，是一种动物专用抗菌药物，主要用于治疗犬和猫的细菌感染。包括普多沙星在内的第3代喹诺酮类药物抗菌谱更广，吸收快，体内分布广，抗菌能力更强，合成简单，价格便宜，被广泛应于动物细菌感染的治疗以及食源性动物的饲养过程中[2-3]。目前，氟喹诺酮类药物滥用的现象也屡见不鲜，动物性食品中的兽药残留问题，越来越受到世界各国的广泛关注。国内外对几种临床上常用的氟喹诺酮药物都制定了相应的最高残留限量（MRL）[4-5]。氟喹诺酮类抗菌药物残留检测方法主要有微生物法、理化法、免疫法等[6-7]。一种快速简便的普多沙星检测方法势在必行。本研究通过N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法[8-10]。将普多沙星与牛血清白蛋白和鸡卵清蛋白成功偶联，获得了普多沙星-BSA和普多沙星-OVA。以人工抗原普多沙星-BSA为免疫原进行免疫试验，并以新西兰大白兔为免疫对象，免疫实验兔制备了普多沙星抗体。运用间接竞争ELISA法[11-14]建立了检测普多沙星的ELISA法，可初步用于普多沙星的残留的检测。

　　1材料与方法

　　1.1试验材料

　　1.1.1试验试剂

　　普多沙星（拜耳公司）、HRP标记羊抗兔IgG（Solarbio公司）、牛血清白蛋白（北京欣经科生物公司）、TMB双组分显色液、乙基二甲氨基碳化二亚胺盐酸盐（EDC）、卵清白蛋白、十二水合磷酸二氢钠（Na 2HPO 4·12H 2 O）、二水磷酸氢二钠（NaH 2 PO 4·2H 2 O）、氯化钠（NaCl）、碳酸钠（Na2HCO3）、碳酸氢钠（NaHCO3）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、弗氏不完全佐剂（Sigma公司）、弗氏完全佐剂（Sigma公司）、明胶、TWEEN-20、干酪素、无水乙醇、乙腈、甲醇、透析袋MD34、96孔板、氯化钠注射液、三通阀。

　　1.1.2试验仪器

　　磁力搅拌器、离心机、电子分析天平、微量可调移液器、恒温培养箱、酶联免疫测定仪、恒温水浴箱、冰箱。

　　1.1.3试验动物

　　试验动物选用健康的新西兰白兔，雌雄各半，体重约2 kg。购自上海吉辉实验动物饲养有限公司。

　　1.2试验条件与方法

　　1.2.1溶液的配置

　　ELISA所需缓冲液：0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS），将NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.44 g（Na2HPO4·12H2O 3.56 g），KH2PO4 0.2 g溶于蒸馏水，定容至1 000 mL。洗涤缓冲液（PBST）：PBS+0.05%TWENE 20。0.05 mol/L NaHCO3/Na2CO3缓冲液（CBS）制备方式：Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，加蒸馏水定容至1 000 mL，置于4℃保存。封闭液：5%脱脂奶粉+1%TWENE 20。显色液：TMB双组分显色液，A液B液混匀后使用。

　　1.2.2透析袋的预处理

　　将透析袋切成适当长度（10～20 cm）的小段。在大容量2%（W/V）碳酸氢钠和1 mmol/L EDTA（pH=8）下，将透析袋煮沸10 min，之后用蒸馏水彻底清洗透析袋，再将其在1 mmol/L EDTA（pH=8）中煮沸10 min。冷却后，储存在4℃中。试验过程中必须确保透析袋总是沉浸在溶液中。用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。

　　1.2.3人工抗原的制备

　　采用改进后的N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法[9-10]（简称NHS酯法）分别合成免疫原普多沙星-BSA和包被抗原普多沙星-OVA。

　　1.2.4动物免疫

　　选择健康的新西兰大白兔3只，体重约为2 kg，免疫前先饲养1周进行适应，观察兔子身体状况，然后耳缘静脉采血，制备阴性对照血清。每次免疫时，每只兔子分别注射1mg免疫原普多沙星-BSA。

　　一免时，取1 mg免疫原普多沙星-BSA，加入1 mL灭菌的PBS中，加入等量的弗氏完全佐剂，乳化后兔背部皮内多点注射。4周后，取等量抗原加弗氏不完全佐剂，乳化后进行背部皮下多点注射，进行加强免疫。每次加强免疫间隔4周，共加免5次。具体免疫方案见表1。第2、3、4次免疫都为皮下注射，第5次免疫为肌肉和静脉注射。第3次免疫过后进行采血分离血清用ELISA方法观察结果。

　　1.3样品采集与分析测定

　　1.3.1动物采血

　　采用兔耳缘静脉采血法。从第三免起，免疫后7 d，从耳缘静脉收集血液。每只兔子采血1 mL。室温静置1h，4℃过夜，离心收集上层血清，进行检测。五免后，心脏大量采血，后耳缘静脉注射空气处死动物。采集的血液先室温静置1 h，再4℃过夜，离心机5 000 r/min，持续10 min，-20℃冰箱保存。

　　1.3.2抗血清与包被原的筛选

　　采用方阵法确定包被原和抗血清的适宜最佳的工作浓度，包被原稀释范围为1/1 000～1/32 000，抗体的稀释范围选择1/400～1/51 200，每板同时设阴性对照，进行间接ELISA试验。

　　1.3.3间接竞争ELISA的建立

　　包被：用包被液将包被原稀释成一系列浓度（1/1 000～1/32 000）加至96空酶标板，每孔100μL，4℃冰箱孵育过夜，洗涤1次，时间为1 min，拍干3次。封闭：用5%脱脂奶粉+1%吐温封闭，每孔150µL，37℃温箱孵育1 h，取出后直接拍干3次。加样：每孔分别先加入不同溶度的药物溶液50μL再加入一系列浓度的待检血清50μL，放入37℃温箱孵育30 min，洗涤4次，每次时间为1 min，拍干3次。加酶：加HRP-羊抗兔IgG（1∶3 000稀释），每孔100μL，放入37℃温箱孵育30 min，洗涤4次，每次1 min。显色：每孔加入新鲜配制的TMB显色溶液100μL，避光室温显色10 min。终止：每孔分别加入终止液（2 mol/L H2SO4）50μL。测定：用酶标仪读取各孔吸光度值OD450。

　　1.3.4标准曲线的绘制

　　标准药物作一系列稀释（0.000 5、0.001 5、0.004 6、0.013 7、0.0412、0.123 5、0.370 4、1.111 1、3.333 3、10、100μg/mL），进行间接竞争ELISA检测。以各浓度下的吸收值OD为纵坐标，以各浓度的对数值为横坐标，采用四参数方程：y={（A－D）/[1+（x/C）B]}+D。绘制标准曲线，计算IC50值。其中A是在没有药物时的最大光吸收值，B是曲线变形点的斜率，C是抑制分析物50%的浓度（IC50），D是在药物浓度无穷大时的最小光吸收值。由IC50值评价ELISA的灵敏度。

　　1.3.5牛奶样品前处理及添加回收试验

　　取牛奶样品1 mL置于小离心管中，10 000 r/min离心30 min，弃脂肪层，取水相上层，用PBS稀释。然后取50μL加入酶标板中进行ELISA检测。

　　2结果与分析

　　2.1人工抗原合成的鉴定

　　本试验采用普多沙星-BSA作为免疫原，分别对普多沙星、BSA和普多沙星-BSA进行紫外图谱扫描，作紫外吸收光谱图，见图1。普多沙星的特征吸收峰在265 nm左右，BSA的特征吸收峰在300 nm左右，通过比较紫外吸收光谱图，可以看出普多沙星-BSA的最大吸收峰与BSA的最大吸收峰相比发生了右移，且在380 nm附近也出现一个小峰，这说明普多沙星与BSA蛋白连接后导致光谱图发生一定程度的变化，初步证明免疫原合成成功。

　　2.2抗血清的筛选

　　通过方阵法来共同筛选最适包被浓度与血清稀释度的组合。如表2所示，A1列分别加入浓度为1μg/mL的药物50μL，A0不加药（用等体积的PBS代替）。分别在每一行中加入2倍稀释的抗血清，浓度见表2。

　　将以上选择的3个组合为最适的包被原和抗体工作浓度的候选，再分别详细进行竞争ELISA检测，结果见图2，选出抑制效果最好的一组作为最佳包被原浓度和抗血清浓度。包被原浓度1∶8 000和血清浓度1∶12 800组效果最好，选取该组继续试验。

　　2.3间接竞争ELISA方法的建立

　　用筛选出最佳的包被原和抗血清浓度建立间接竞争ELISA方法，绘制标准曲线。由图3可知，本方法对药物的半数抑制浓度（IC50值）为0.308 92μg/mL，20%抑制浓度（IC20值）为0.023 8μg/mL，作为本方法的检测限。

　　2.4牛奶样品添加回收试验

　　初步研究了普多沙星在牛奶中的添加回收试验。根据间接竞争ELISA方法所得曲线，通过代入所测牛奶样品的OD值为Y，即可求出相应X值，即实测药物浓度。在牛奶中添加了终浓度为10μg/mL的药物，稀释10倍后，计算得出牛奶样品添加回收率约为76%。

　　3讨论

　　3.1免疫方法和免疫途径的选择

　　在抗体制备的过程中，免疫方法和免疫途径的合理性对抗体建立的成功率有很大的影响[15]。合理的免疫方法包括合适的免疫动物、免疫部位、免疫频率以及佐剂的选择等[16-17]。免疫的一般途径为皮下、皮内、肌肉和腹腔注射，本研究采用皮内、皮下、肌肉多途径注射的方式，以达到最佳免疫效果[18-19]。研究表明，首次免疫采用皮内多点注射的方式，因其免疫效果比其他免疫方式好，且对动物刺激小，之后几次则免疫采用皮下多点注射或皮下肌肉多点混合注射[20-21]。

　　3.2抗血清的筛选以及间接竞争ELISA方法的建立

　　目前ELISA检测技术是比较简便高效的药物残留分析技术之一[22-25]。但其灵敏度和稳定性会受多种因素影响，包括包被原浓度、标准品稀释液种类以及竞争反应时间长短等，所以选择合适的反应条件是至关重要的[11,26]。

　　包被原浓度对抗原抗体反应有直接影响，适当稀释可有助于标准品分散，反应时长也会影响抗原抗体的结合程度[27]。除了受抗体特异性影响，ELISA检测效果也受酶标板吸附性能、抗原抗体浓度等因素影响。增加抗体浓度可提高测量信号值，降低检测限，而降低包被抗原浓度可增加竞争物抑制率，影响结果准确性[28-30]。

　　4结论

　　本研究成功合成了普多沙星的人工抗原普多沙星-BSA，选用普多沙星-BSA为免疫原免疫实验兔制备了普多沙星的多抗血清。本研究选用的包被液为碳酸盐缓冲液，封闭液为5%脱脂奶粉+1%吐温，包被抗原的最佳工作浓度为1:8 000，抗血清最佳稀释度为1:12 800，以此建立了检测普多沙星的间接竞争ELISA方法，本方法的检测限0.023 8μg/mL，检测范围为0.023 8～4.010μg/mL，可初步用于普多沙星残留的检测。

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