摘要：为建立一种灵敏特异的检测鹦鹉喙羽症病毒PCR方法，给临床快速诊断鹦鹉喙羽症提供技术支持，根据Genbank上公开的鹦鹉喙羽症病毒基因序列，比对分析找出高保守区域，设计了1对检测引物，提取鹦鹉喙羽症病毒阳性样品DNA模板，对扩增体系和反应条件进行一系列调整，确定理想的PCR反应方案；通过10倍梯度稀释DNA模板法，确定该检测方法的灵敏度极限；应用该方法检测传染性法氏囊炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、鸡痘病毒和Ⅰ群禽腺病毒4型这6种禽病病原，确定方法的特异性；运用该PCR方法检测90份临床样品，测试其实用性。结果表明，设计的检测引物能特异性扩增鹦鹉喙羽症病毒，其它6种家禽病毒均为阴性，其检测DNA浓度的下限是3.725×10-6 ng/µL。临床应用表明，90份疑似病料有28份为阳性，阳性率为31.1%。成功建立了一种灵敏度高、特异性好的鹦鹉喙羽症病毒PCR方法。

　　关键词：鹦鹉喙羽症；病毒；聚合酶链式反应；检测；诊断

　　0引言

　　鹦鹉喙羽症（PBFD）的病因源自鹦鹉喙羽症病毒（PBFDV），此病毒主要诱发鹦鹉的喙部及羽毛发生病理变化，其特征为高传染性、发病迅猛且致死率高[1-2]。该疾病最初于1970年代中期在南太平洋地区的鹦鹉种群中被识别，典型症状包括羽毛生长紊乱、脱落以及鸟喙形态异常，最终因机体免疫力下降导致继发感染而死亡[3-4]。此后，陆续在诸如葵花鹦鹉、非洲灰鹦鹉、折衷鹦鹉、爱情鹦鹉、虎皮鹦鹉、亚马逊鹦鹉、金刚鹦鹉以及小鹦哥等多种鹦鹉品种中确认了PBFDV的感染现象[5-6]。当前，针对PBFDV的确诊手段尚处于起步阶段，本研究旨在基于PBFDV的保守基因设计一种基于PCR技术的诊断方法，旨在为临床提供一种针对鹦鹉PBFDV感染的高敏感度、高特异性检测工具。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1病料来源

　　由特种禽类病原快速诊断方法课题组采集鹦鹉组织病料或羽髓样品90份，其中组织样30份、羽髓60份。样品来源于咸阳市、西安市、宝鸡市和渭南市的6个鹦鹉繁育场。PBFDV阳性样品由课题组鉴定保存于咸阳市动物疫病分子生物学诊断技术研究重点实验室。

　　1.1.2参考病毒

　　传染性法氏囊炎病毒（IBDV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、新城疫病毒（NDV）、传染性喉气管炎病毒（ILTV）、鸡痘病毒（FPV）均购自兽药市场弱毒活疫苗，Ⅰ群禽腺病毒4型SX17株由咸阳市动物疫病分子生物学诊断技术研究重点实验室分离保存。

　　1.1.3试剂与仪器

　　DNAiso Reagent、RNAiso plus、rTaq酶、dNTP等为宝生物工程（大连）有限公司产品。PCR仪，美国ABI公司ProFlex型；高速冷冻离心机，德国艾本德公司5424R型；超微量紫外—可见光分光光度计，美国Thermo公司NanoDrop one型。

　　1.2方法

　　1.2.1病料处理

　　将采集组织或羽髓置于灭菌的烧杯中，加入5倍量的灭菌生理盐水，剪碎后移入组织研磨器中，反复研磨处理，将混悬液冻融3次，12 000 r/min离心10 min，收集上清液，-70℃超低温冰箱保存备用。

　　1.2.2引物设计与合成

　　依据GenBank上公开的AF311299、AF311300以及AF311301基因组序列，经过比对分析，根据基因高保守区域，设计了1对检测引物，引物的序列：PBFDV-F：5’-AGCGATTTGGATAATGAGAAGTA-3’，PBFDV-R：5’-CCCGGG GGGCCGTA CACA AC GT-3’，预期扩增长度为260 bp。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

　　1.2.3 PBFDV阳性样品中DNA的提取

　　取1.5 mL无菌无酶离心管，吸取100µL PBFDV阳性样品上清液，随后添加700µL DNAiso Reagent，混合均匀后静置进行细胞裂解，持续时间为10 min。接着，加入预先在-20℃条件下冷冻保存的无水乙醇600µL，再次混合均匀后，静置10 min以便DNA沉淀。接下来，将离心管置于4℃条件下，以12 000 r/min的转速离心10 min。离心结束后，去除上清液，然后使用1 mL-20℃条件下储存的70%乙醇进行2次洗涤，每次洗涤后均需弃去乙醇。随后，将离心管倒置于无菌滤纸上，自然晾干至管壁无明显液体残留。最后，使用40µL超纯水充分溶解所提取的DNA。

　　1.2.4 PCR检测方法的建立

　　以该DNA为模板，对扩增体系和反应条件进行一系列调整，以期确定理想的PCR反应方案。在PCR反应体系构建中，包括以下组分：2.0µL的DNA溶液，2.5µL的10×Buffer，1.0µL的dNTP，以及分别0.5µL的PBFDV-F和PBFDV-R引物。rTaq DNA聚合酶的用量在此过程中采用了梯度增加法，其用量范围设定在0.25～1.0µL，以期探索最佳酶浓度。最后，通过加入适量超纯水将总体积补足至25.0µL。针对PCR反应条件的设定，先进行95℃的预变性步骤，持续时间为5 min。随后进入循环阶段，每个循环包括94℃的变性步骤（持续30 s），以及退火步骤（初始温度为52℃,之后以每循环递增1℃的方式逐步升高至58℃,每个退火步骤持续30 s）。随后72℃40 s。此循环过程总共进行35次。循环结束后，72℃充分延伸5 min。反应完成后，通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行观察，以评估反应效果。

　　1.2.5灵敏性试验

　　通过使用微量紫外—可见光分光光度计对所提取DNA的浓度进行测定，按10倍梯度稀释DNA溶液共11个浓度，用建立的方法进行PCR反应，反应完毕后琼脂糖凝胶电泳观察结果。

　　1.2.6特异性试验

　　按照RNAiso plus操作说明提取NDV、IBDV核酸并反转录获得cDNA；提取ILTV、FAdV、FPV等DNA病毒DNA模板，用建立的PCR方法检测，PCR产物琼脂糖凝胶电泳，成像系统中观察照相。

　　1.2.7临床检测应用

　　应用建立成功的PBFDV检测方法，对收集的90份疑似病例病料进行检测分析。

　　2结果与分析

　　2.1 PBFDV PCR检测方法的建立

　　通过扩增体系和反应条件的探索，确定最佳PCR方案为，一个PCR反应体系中，各成分的量分别为超纯水19.0µL，DNA溶液2.0µL，10×Buffer 2.5µL，dNTP 1.0µL，PBFDV-F、PBFDV-R各0.5µL，rTa q DNA聚合酶0.5µL；反应最优条件：95℃预变性5 min，进入循环94℃30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，共进行35个循环，最后72℃延伸10 min。

　　2.2 PBFDV PCR检测方法灵敏性试验

　　用微量紫外—可见光分光光度计测定阳性样品DNA浓度为372.5 ng/µL，A260/A280为1.94，提示DNA纯度很高。11个浓度梯度为模板进行PCR扩增的结果见图1。从图1可知，特异性条带出现的最后一孔为109稀释，换算浓度后确定建立的PCR方法检测的极限为3.725×10-6 ng/µL，提示建立的方法有很高的灵敏度。

　　2.3 PBFDV PCR检测方法特异性试验

　　选取了NDV、IBV、IBDV这3种RNA病毒的反转录产物cDNA作为模板，以及ILTV、禽腺病毒（FAdV）、FPV这3种DNA病毒的DNA作为模板，应用建立的检测方法进行PCR扩增。PCR反应完成后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，通过条带位置和大小判断是否存在目的基因的扩增。结果如图2显示，仅阳性样品在电泳图谱中呈现出预期的260 bp大小的目的条带，清晰且亮度适中，而其余6种禽类常见病毒（NDV、IBV、IBDV、ILTV、FAdV、FPV）均未能在凝胶中观察到对应目的条带，表现为阴性结果。表明建立的PCR方法具有极高的特异性。

　　2.4 PBFDV PCR检测方法临床检测

　　为验证所建立的PBFDV PCR检测方法在实际病例检测中的应用效果，对临床采集的90份具有典型临床症状且疑似感染PBFDV的鹦鹉病料样本进行检测。这些样本来源于不同地域、不同品种、不同年龄阶段的鹦鹉，其临床表现涵盖了鹦鹉喙羽症的多种典型症状，如羽毛异常、喙部畸形、食欲减退、体重下降等，具有较高的疑似诊断价值。严格按照所建立的PBFDV PCR检测方法进行试验，根据电泳图谱分析，共有28份样本显示出与阳性对照相符的特异性条带，即在预期位置出现了清晰且强度适中的260 bp大小的扩增产物（图3），确定为PBFDV PCR检测阳性，阳性率达到31.1%，证明了该检测方法在实际病例检测中的有效性和实用性。

　　3讨论

　　随着生活水平的提高，观赏鸟类的鹦鹉养殖量逐年增加，但由于PBFDV的感染对鹦鹉养殖危害巨大，为准确诊断控制PBFDV感染，急需开发相应的快速诊断技术。本研究根据PBFDV基因序列，比较选择高保守区域，设计了1对检测引物，灵敏度试验表明，该方法检测的极限是3.725×10-6 ng/µL。特异性检测发现，该检测引物与常见的禽类病毒NDV、IBV、IBDV、ILTV、FAdV、FPV无交叉反应，扩增均为阴性结果，表明特异性良好。提示所建立的方法灵敏性、特异性良好，可作为临床快速检测方法。另外，该方法为常规PCR方法，成本更低，普通分子实验设备即可完成，更适合基层实验室大范围进行流行病学调查。应用该方法检测临床90份病料，28份为阳性，阳性率为31.1%，提示陕西省内鹦鹉养殖场PBFDV临床感染率较高，需要高度关注PBFDV的防控工作。

　　参考文献

　　[1]常巍，陈科元，杨世丽，等．福建省部分地区鹦鹉喙羽病的分子流行病学调查及其病原Cap蛋白抗原表位预测[J]．畜牧与兽医，2021，53（2）：71-76.

　　[2]Ramis A，黄瑜．虎皮鹦鹉同时暴发喙羽病病毒和多瘤病毒感染[J]．国外畜牧科技，1999（6）：37-40.

　　[3]赵辉，刘佳卉，孙健，等．一起鹦鹉多重混合感染的诊治[J].中国动物检疫，2020，37（10）：131-135.

　　[4]吴汝娟，李玉杰，谢立香，等．山东省3家鹦鹉养殖场多瘤病和喙羽病的病原检测与序列分析[J]．中国动物检疫，2020，37（3）：103-108.

　　[5]陈科元．PBFDV的分子流行病学调查及其诱导宿主天然免疫应答的初步研究[D]．福州：福建农林大学，2018.

　　[6]陈晓勇．新分离的鹦鹉喙羽病病毒的全基因组序列分析及Cap、Rep蛋白的克隆和表达[D]．福州：福建农林大学，2018.