摘要：2023年6月，吉林省图们市某牛场黄牛出现贫血、消瘦、反刍障碍和血红蛋白尿等症状。为分析病牛的发病原因，对其进行临床初步诊断和PCR检测。PCR检测结果显示，卵形巴贝斯虫和嗜吞噬细胞无浆体均为阳性。系统进化分析显示，试验获得的卵形巴贝斯虫吉林株与日本株亲缘关系较近；嗜吞噬细胞无浆体吉林株与韩国株亲缘关系较近。该文为吉林省牛卵形巴贝斯虫病和嗜吞噬细胞无浆体病的综合防治提供理论依据。

　　关键词：卵形巴贝斯虫；嗜吞噬细胞无浆体；诊断

　　0引言

　　牛的卵形巴贝斯虫病是一种经媒介蜱传播的血液原虫病。卵形巴贝斯虫主要寄生于牛的红细胞内，是一种大型的虫体，其虫体的长度大于红细胞的半径，多以梨籽形、圆形为主。该病的发生和流行与传播媒介蜱的消长、活动密切相关。卵形巴贝斯虫的传播媒介为长角血蜱，因蜱的活动具有明显的季节性、分布具有地区性，因此该病的发生和流行也具有明显的季节性和地区性。牛感染卵形巴贝斯虫主要的临床表现为消瘦、贫血、反刍障碍，外地牛感染严重时可引起死亡。无浆体是一种由革兰氏阴性菌引起的，动物和人共患的细菌性疾病。嗜吞噬细胞无浆体是无浆体的主要种类之一，其传播媒介为蜱，具有明显的季节性，与蜱的活动密切相关。嗜吞噬细胞无浆体可侵害各个生长阶段的牛，尤其是年龄较大的牛感染后较严重。该病的主要病原为病牛、处于潜伏期尚未发病的牛和已经康复后体内带菌的牛。因嗜吞噬细胞无浆体对环境抵抗力较弱，通过环境直接传播的几率较低，牛群感染主要通过蜱虫传播。牛感染后主要表现为粘膜苍白、贫血、淋巴结炎，生长发育变慢。牛感染卵形巴贝斯虫和嗜吞噬细胞无浆体其症状较为相似，因均为媒介蜱传播，临床上多为混合感染。2023年6月，吉林省图们市某养殖户黄牛放牧5 d后相继出现反刍障碍、贫血、消瘦等临床症状，犊牛症状较严重，出现血红蛋白尿、腹泻、精神沉郁、卧地不起。经临床症状初步疑似梨形虫和无浆体感染，对发病牛进行PCR检测，病牛确诊为卵形巴贝斯虫和嗜吞噬细胞无浆体混合感染。

　　1发病情况

　　吉林省图们市某养殖户放牧黄牛，2023年6月部分牛出现体温升高，流涎，食欲减退，血红蛋白尿，眼黏膜发黄，排黑便，在四肢和颈部发现吸血后蜱虫。对病牛使用青霉素、链霉素进行治疗，治疗效果不明显，牛群停止放牧改为圈养，并对圈舍进行消毒。采集病牛的血液较稀薄，同时进行血涂片，采集抗凝血放入冰盒内进行实验室PCR检测。

　　2病理变化

　　对1头病死犊牛进行剖检发现，被毛无光泽，消瘦，眼结膜黄染；皮下组织、浆膜呈黄色胶冻状；肝脏肿大呈黄褐色，胆囊肿大扩张；肾脏肿大，有点状出血；膀胱膨大，内有红色尿液；脾脏肿大，髓质变脆；心内外膜有出血点、斑，血液稀，不易凝；体腔有大量渗出物；胃肠道黏膜肿胀、潮红点状出血；真胃黏膜出血，小肠有卡他性炎症。

　　3 PCR检测

　　病牛全血DNA的提取按照DNA试剂盒操作方法进行DNA提取。利用在线引物设计软件，根据嗜吞噬细胞无浆体16S rRNA基因序列（MW672121），设计1对特异性引物，嗜吞噬细胞无浆体上游引物5′-CGCAAGACTAAAACTCAAAGG-3′；下游引物：5′-ACAAGACCCGAGAACGTATTC-3′；卵形巴贝斯虫引物根据试验室先前已设计的引物合成引物；引物由吉林省库美生物技术有限公司合成。

　　反应体系如下：TaKaRaTaq 0.25μL，卵形巴贝斯虫、嗜吞噬细胞无浆体上、下游引物各0.5μL，dNTP 2μL，PCR Buffer 2.5μL，基因组DNA 2.5μL；dd H2O 16.75μL；反应条件预变性、变性及延伸按常规温度进行，退火温度选择为55℃、1 min。阳性PCR产物送往吉林省库美生物技术有限公司测序。

　　4诊断

　　4.1初步诊断

　　根据临床症状、发病季节和病理剖检，初步诊断为梨形虫感染。

　　4.2 PCR检测结果

　　对发病牛血液DNA分别用卵形巴贝斯虫、嗜吞噬细胞无浆体特异性引物进行PCR检测。结果显示，病牛血液DNA中卵形巴贝斯虫和嗜吞噬细胞无浆体PCR检测均为阳性，见图1、图2。

　　4.3卵形巴贝斯虫与嗜吞噬细胞无浆体系统进化分析

　　PCR产物经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收后，对回收产物进行测序。结果显示，与卵形巴贝斯虫日本株（LC125457）核苷酸同源性为99.59%；与嗜吞噬细胞无浆体韩国株（MF787270）核苷酸同源性为99.40%。结合测序结果，病牛诊断为卵形巴贝斯虫和嗜吞噬细胞无浆体混合感染。遗传进化树分析显示，本试验测序获得的卵形巴贝斯虫吉林株与日本分离株处于同一分支，亲缘关系较近；嗜吞噬细胞无浆体吉林株与韩国株处于同一分支，湖北分离株单独处于一个分支，与韩国株亲缘关系较近。

　　5治疗方法

　　国内尚未研制出卵形巴贝斯虫和嗜吞噬细胞无浆体疫苗，尚无特效药物治疗，多采用对症治疗方法进行治疗。对早期感染病牛停止放牧，改为圈养，体内外注射驱虫药驱除蜱虫。嗜吞噬细胞无浆体为革兰氏阳性菌，对病牛隔离治疗，加强护理，可肌肉注射四环素、金霉素或土霉素等药物治疗有效，连用5 d。用含有纯中央亚种的新鲜脱纤血给牛皮下注射，使牛产生抵抗力，愈后可产生带菌免疫，治疗效果较好。卵形巴贝斯虫感染治疗方法：①三氮眯（贝尼尔），5%溶液做深部肌肉注射和皮下注射。②吖啶黄、黄色素、锥黄素。用蒸馏水或生理盐水配成0.5%～1%溶液，静脉注射，注射前加温至37℃。③咪唑苯脲、咪唑啉卡普，配成10%的水溶液，肌肉注射或皮下注射。④硫酸喹啉脲，阿卡普林、抗焦素。对病牛可进行补液、强心、止血、健胃、缓泻，还应考虑给予抗菌素防止继发感染，对严重贫血病牛可进行输血。

　　6预防

　　牛卵形巴贝斯虫和嗜吞噬细胞无浆体病的感染呈逐年上升趋势，临床症状不明显，多为隐形感染。国内对以上2种疾病病原学和诊断技术方面取得一定进展，还没有有效的控制措施。因其传播媒介均为蜱虫传播，具有一定的季节性，灭蜱是防制该病的关键。可根据流行地区蜱的活动规律进行灭蜱。经常用杀虫药消灭牛体表寄生的蜱，保持圈舍及周围环境的卫生，以防经饲草和用具将蜱虫带入圈舍。在放牧时对牛体表皮肤喷洒杀虫剂，及时观察颈部和四肢皮肤是否被蜱虫叮咬。在外地购买牛，应选择无蜱虫活动季节，在调入、调出前应作药物灭蜱处理。对牛群由安全区向疫区输入牛，可应用咪唑苯脲进行药物预防。

　　7诊断与体会

　　牛卵形巴贝斯虫和嗜吞噬细胞无浆体的传播媒介均通过蜱传播，因此牛出现卵形巴贝斯虫和嗜吞噬细胞无浆体混合感染2种病原较为常见。目前，有关卵形巴贝斯虫和嗜吞噬细胞无浆体的检测方法主要为血液涂片镜检及PCR检测方法。在发病初期与普通发热疾病症状较为相似，使用抗生素和抗病毒药治疗效果不明显，在感染早期，血液涂片检测法对检查人的专业水平较高，需要与其它感染血液病原体进行鉴别诊断，容易出现误诊。分子生物学检测技术中的PCR方法具有敏感性、特异性强及准确性高的特点，可进行早期诊断，较适合基层兽医部门临床应用。

　　牛卵形巴贝斯虫病在河南、甘肃、四川等多个省份均有该病的报道，经调查发现吉林省也是卵形巴贝斯病流行的主要地区，对牛的危害十分严重，其感染率高达30.52%。有关牛感染嗜吞噬细胞无浆体流行病学调查的研究报道较少，李红旺等调查显示，吉林省珲春、松原地区牛嗜吞噬细胞无浆体阳性率分别为7.5%和12.5%。吴泽功等对新疆北部地区牛感染嗜吞噬细胞无浆体阳性率为10%。为确诊吉林省图们市某养殖户发病牛感染病原体种类，本试验对病牛进行临床诊断和PCR检测。临床诊断发现病牛体表有大量吸血蜱虫，随着病程的发展病牛出现血红蛋白尿，初步怀疑梨形虫感染。PCR检测结合测序结果显示，在牛血液中检测出卵形巴贝斯虫与和嗜吞噬细胞无浆体混合感染。有关以上2种疾病混合感染的报道较少。分析原因可能是病牛在放牧后相继发病，蜱虫是卵形巴贝斯虫和嗜吞噬细胞无浆体传播媒介，病牛因被蜱虫叮咬进而混合感染以上2种病原体。进化树分析表明，不同地区牛体内的卵形巴贝斯虫和嗜吞噬细胞无浆体存在基因差异，可能与环境因素及蜱虫种类有关。系统进化树分析结果表明，卵形巴贝斯虫不同地区分离株存在差异，本次分离获得的吉林株与日本分离株处于同一分支，亲缘关系较近。嗜吞噬细胞无浆体吉林株与韩国分离株处于同一分支，亲缘关系较近。分析以上原因可能是吉林省与日本、韩国地理位置较近，动物之间交流有关。

　　牛卵形巴贝斯虫病对外地引进牛和犊牛感染后症状较为严重，当地牛感染多为带虫免疫症状不明显。嗜吞噬细胞无浆体为细胞内寄生，可在牛中性粒细胞中繁殖，同时可在蜱虫体内完成生长周期，能够抑制宿主细胞的正常的杀菌，进而导致机体感染。血液涂片镜检红细胞内发现卵形巴贝斯虫和嗜吞噬细胞无浆体是常用的诊断方法，但因早期感染时染虫率较低，容易出现漏检，通过可靠准确的诊断方法是防制以上2种疾病的关键。随着分子生物学技术的快速发展，应用PCR技术对卵形巴贝斯虫和嗜吞噬细胞无浆体进行病原学诊断，为以上2种疾病的防治和流行病学调查提供更为有效的方法。

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