摘要：马流行性感冒是马A型流感病毒感染导致的一种急性呼吸道传染病。该病流行范围广，传播速度快，呈急性爆发。许多赛马机构和马术团体制定强制免疫政策，但疫苗免疫不能做到无病毒免疫，免疫动物仍可能向外排毒，成为马流行性感冒病毒传播的传染源，严重影响我国马产业的健康发展。及时的实验室诊断和疫苗免疫对于马流行性感冒的预防具有重要意义。该文主要论述马流行感冒的病原学特征、流行病学及临床症状展开叙述，总结近年马流行性感冒的实验室诊断方法及疫苗研究进展，以期为该病的诊断和防控提供参考。

　　关键词：马流行性感冒；诊断；疫苗

　　Progress on Laboratory Diagnose and Vaccinum Investigate for Equine Influenza CHEN Yunlei1，DING Linling1，LIU Lu1，YUAN Weiqin1，ZHANG Zelin1，GAN Lingfeng1，

　　SHAO Tingting1，ZHANG Shuai2*

　　（1.TongluEquine Disease Free Zone Management Center，Hangzhou Zhejiang 310000，China；

　　2.Department of Animal Science，Ganzhou Vocational and Technical College，Ganzhou Jiangxi 341000，China）

　　Abstract：Equine influenza is an acute respiratory infectious disease caused by equine influenza A virus infection．It has a wide range of prevalence，rapid transmission，and acute outbreak．Many horse racing institutions and equestrian groups have established mandatory immunization policies，but vaccine immunization cannot achieve virus free immunity．Immunized animals may be able to detoxify and become a source of transmission for EIV，seriously affecting the healthy development of China's horse industry．Therefore，promptly laboratory diagnosis and vaccine immunization are of great significance for the prevention of equine influenza．This article describes the etiological characteristics，epidemiology and clinical symptoms of EI，and summarizes the laboratory diagnosis methods and vaccine research progress of equine influenza in recent years，in order to provide references for the diagnosis and prevention of EI.

　　Keywords：equine influenza，diagnose，vaccinum

　　0引言

　　马流行性感冒（Equine influenza，EI）简称马流感，是马A型流感病毒（Equineinfluenzavirus，EIV）感染导致的一种急性呼吸道传染病，马、驴、骡等马属动物均易感[1]。潜伏期为2～10 d，临床以高热、流黏脓性鼻液、强烈干咳等症状为主，偶见化脓性支气管炎，严重者可引起急性死亡，目前以H3N8亚型为主。该病流行范围广，传播速度快，呈急性爆发。世界动物卫生组织（WOAH）将其列为须通报的动物疫病，我国将其列为三类动物疫病。在EI流行地区，常通过疫苗接种降低经济损失。许多赛马机构和马术团体也制定了强制免疫政策，但疫苗免疫不能做到无病毒免疫，免疫动物仍可能向外排毒，成为EI传播的传染源。因此，及时的实验室诊断和疫苗免疫对于EI的预防具有重要意义。本文就EI的病原学特征、流行病学及临床症状展开叙述，总结近年来EI的实验室诊断方法及防控的研究进展，以期为EI的诊断和防控提供参考。

　　1 EIV的病原学特征

　　EIV是属于正黏病毒科、流感病毒属A型流感病毒，病毒粒子呈现球形或纤维型，由双层脂质囊膜组成，能感染马、驴、骡等马属动物[2]。而引起马属动物发病主要是A型流感病毒的H7N7亚型（又称亚型1）和H3N8亚型（又称亚型2）2种亚型，但近30年来少见有H7N7亚型报告。

　　1.1 EIV基因组结构

　　EIV基因组全长约13.6 kb，单股负链RNA。由6个可编码血凝素蛋白（HA）、神经氨酸酶（NA）、核蛋白（NP）和3个聚合酶亚基（PA、PB1和PB2）节段，1个节段编码非结构蛋白（NS1和NS2）及1个核输出蛋白（NEP）组成[3]。

　　1.2 EIV编码蛋白功能

　　病毒由来源于宿主细胞的双层脂质囊膜构成。另外还有2种重要的糖蛋白，第1类占总膜蛋白的90%，呈棒状，可构成三聚体，介导病毒侵入的HA蛋白，是主要表面抗原之一，使病毒在宿主内定殖。第2类占总膜蛋白的10%，介导病毒释放的四聚体，由神经氨酸酶（NA）组成，可以促进病毒从宿主体内释放，也是一个主要的表面抗原。囊膜内层由基质蛋白（M1和M2）构成，具有介导RNA的输出、剪接和翻译及参与病毒RNA从核仁输出功能。

　　2 EIV流行病学特征

　　2.1传染源

　　EIV潜伏期为2～10 d，《陆生动物卫生法典》中EI潜伏期最长规定为21 d，传染源一般为患病动物或隐性感染动物。同时免疫接种的感染动物若仍可向外排毒，也会成为同群动物的传染源。

　　2.2传播方式

　　EIV多为呼吸道传播飞沫传播，也可通过消化道或生殖道途径。此外，也可由工作人员、运输工具及污染物间接传播。易感马潜伏期可能不到24 h，有部分免疫力的动物潜伏期会延长，可能仅出现部分临诊症状，疫病传播可能也有限。

　　3 EI临床症状

　　目前，马体内EIV分离株主要为H7N7亚型和H3N8亚型，其中H7N7亚型比较温和，H3N8亚型较重。潜伏期为2～10 d。一般表现为轻微的呈顿挫型或隐性感染。呈稽留热，如反复稽留热则怀疑继发感染。症状可由干咳转为湿咳，持续时间长。鼻炎可由流水样转为黏稠的鼻液。H7N7亚型一般为喉炎，继发时则表现为喉、咽和喉囊症状。发热时，食欲降低，呼吸脉搏降低，精神沉郁，眼结膜充血水肿。肌肉震颤，因肌肉酸痛而不爱活动[3]。

　　4 EIV实验室诊断方法

　　EIV最早可由流行情况、临床症状和病理变化初步判断。而确诊EIV的实验室方法主要是通过鸡胚病毒分离、细胞培养病毒分离及RT-PCR等病原鉴定和血凝抑制试验（HI）、抗原捕获ELISA和间接ELISA等血清学检测方法。

　　4.1病原鉴定

　　4.1.1鸡胚病毒分离

　　利用鼻咽拭子或鼻和气管冲洗物混匀后加入双抗接种9日龄的鸡胚，将接种后的鸡胚转移至37℃培养箱中培养48～72 h，收集尿囊液或羊水使用血凝试验（HA）检测其是否含有病毒，如果HA试验检测阳性，则可以使用RT-PCR方法开展病毒亚型鉴定。但该方法需要时间长，对样品要求较高，不适于大批量检测。

　　4.1.2细胞培养病毒分离

　　可使用Mad in-Darby犬肾细胞系（MDC K，ATCCCC34）或Vero细胞分离EIV。将使用双抗处理后的鼻咽拭子或鼻和气管冲洗物混合后接种至细胞中，可通过观察细胞病变情况初步判断是否含有流感病毒。在接种病毒细胞培养48 h后收集细胞培养上清液开展HA试验对琼进行鉴定，若鉴定HA阳性再用RT-PCR确定病毒亚型。但该方法需要时间长，对样品要求较高，不适于大批量检测。

　　4.1.3普通PCR方法

　　普通PCR方法是实验室病原学最常用的检测方法，PCR方法首先对病原RNA反转录生成cDNA，再进行PCR检测获取目的基因，实现对病原检测。具有敏感、快速和特异等优点。戴伶俐等根据EIV的M基因和HA基因的保守序列，设计了MF和MR为2对通用引物，通过对双重RT-PCR扩增条件的优化，建立快速检测鉴别H3N8亚型EIV的双重RT-PCR技术。该方法与EIAV、EAV、EHV等主要马属动物病毒扩增无交叉反应。最低核酸检出浓度为5.4 ng/mL。可同时实现快速诊断和亚型鉴定，耗时短。然而，该方法对操作人员要求高，不适于定量分析。

　　4.1.4荧光PCR方法

　　荧光PCR方法是在常规PCR基础上发展而来，无需开展扩增产物电泳检测，即可实现对扩增信号检测结果的直接判读。林志雄等[4]针对马流感H3N8序列HA和NA基因序列建立一种实时荧光RT-PCR技术。该方法最小检测浓度为3.36×102 copies/μL，特异性强，是常规PCR的2.3倍，且与病毒分离100%符合。该方法是目前实验室检测最常用的方法之一，灵敏性高，特异性强。但需要仪器昂贵，对操作人员要求较高，不适于定量分析。

　　4.2血清学检测

　　4.2.1血凝抑制试验（HI）

　　HI试验是免疫效价检测中最常用的方法，是通过血清中抗原抗体结合后，从而使病毒中的血凝素不能凝集红细胞。为保证试验的准确性需提前对血清进行失活处理以免凝血酶对HI试验造成干扰。另外，哈尔滨兽医研究所通过采用乙醚处理病毒抗原用以增强敏感度，让HI试验变的更加稳定。该方法对免疫抗体效果水平监测具有重要作用，但不易于前期检测。

　　4.2.2抗原捕捉ELISA

　　抗原捕捉ELISA是WOAH指定的检测方法，是利用EIV单克隆抗体建立的一种直接检测病料的方法，具有特异性高和敏感性好优点，对大批量检测具有便捷性。姬媛媛等[5]根据EIVA/马/新疆/07(H3N8)株建立了单克隆抗体2G11与抗EIV多抗和抗NP多抗的4种抗原捕捉ELISA方法，与多重RT-PCR检测结果符合，可检测到攻毒后3～7 d病毒粒子，可实现大批量样本快速检测，适用于流行病学监测。

　　4.2.3间接ELISA

　　间接ELISA是以灭活的病毒或重组蛋白为包被抗原检测马血清EIV抗体，可实现对血清中EIV抗体水平检测来诊断EI。具有较高特异性和敏感性。何栋等[6]根据EIVA/马/黑龙江/13株NP基因建立一种EIV抗体的间接ELISA方法。该方法与马鼻肺炎病毒、马传染性贫血病毒及马红球菌的阳性血清均无交叉反应，具有较高的特异性；与HI试验相比，该ELISA方法有更高的敏感性。ELISA是目前实验室检测最常用的方法之一，可实现大批量抗体检测，适合于流行病学监测。

　　5疫苗研究进展

　　EI是一种自限制性疫病，所带来的经济损失主要是因为病毒的传染性和对马匹活动的影响。快速诊断、限制移动和疫苗免疫接种是控制EI的关键措施。

　　5.1灭活疫苗

　　灭活疫苗是包含病毒所有蛋白、脂质和核酸的疫苗。具有安全性高、免疫保护性好的特点，可制备互不干扰的二价疫苗。世界上多个国家均采用EIV灭活疫苗。70年代我国成功研制马甲1型（H7N7）单苗、马甲2型（H3N8）单苗和马流感联苗三种疫苗。但由于免疫后产生的IgG（T）抗体不能结合补体导致免疫失败，而未大面积使用。

　　5.2亚单位疫苗

　　亚单位疫苗是利用分子生物学技术表达EIV的某种表面蛋白（一般为HA蛋白和NA蛋白）诱发机体产生抗体的疫苗。但由于部分表面蛋白并无法模拟抗原表位的天然构象，因此，免疫原性较弱，且免疫保护时间短。

　　5.3弱毒疫苗

　　弱毒疫苗是指病原经甲醛处理后，其内部结构发生变化，毒性变弱，保留的部分活性侵入机体后可迅速开始复制，激发产生免疫应答。与传统灭活疫苗相比更具优势，既激发细胞免疫又诱导体液免疫，但存在一定的安全问题，限制了其广泛应用。

　　5.4核酸疫苗

　　核酸疫苗主要是通过分子生物学技术构建具有保护性抗原基因的表达重组质粒，免疫后能刺激机提产生特异性免疫应答反应。贺笋等[7]通过利用马流感病毒H3N8亚型HA基因和NA基因序列进行串联构建了一种具有抗原性好、表达量高的融合蛋白，用以制备疫苗，免疫后表现出较高的抗体滴度，对动物机体具有较好的保护效果。

　　6小结

　　马流行性感冒是严重危害我国马产业的重要传染病。自从我国发生4次大流行之后，近年来我国EI虽然没有大规模暴发的报道，但根据相关马属动物疫病的流行病学调查发现，我国仍存在区域性流行。针对这种情况，首先，应执行严格的检疫防疫制度，及时淘汰阳性动物。新引进动物马属动物时，在执行严格检疫的同时做好对应的隔离饲养工作，充分排除隐性感染的可能。其次，加强饲养管理搞好厩舍及环境卫生，定期消毒。最后，针对群体免疫效果水平低者应及时补免，加强免疫。

参考文献

　　[1]农业农村部畜牧兽医局组译．OIE陆生动物诊断试验与疫苗手册[M]．8版，北京：中国农业出版社，2021.

　　[2]姜伟，徐聪，楚遵锋，等．山东省部分养殖场点马属动物主要病毒疫病调查[J]．中国动物检疫，2022，39（1）：10-12.

　　[3]张佳琦．基于B细胞分离技术筛选马流感中和抗体[D]．北京：中国农业科学院，2021.

　　[4]林志雄，鱼海琼，王莹，等．马流感H3N8实时荧光RT-PCR检测方法的建立[J]．湖北农业科学，2019，58（17）：129-131.

　　[5]姬媛媛．马流感病毒抗原捕捉ELISA检测方法的建立及其初步应用[D]．北京：中国农业科学院，2011.

　　[6]何栋，卢刚，罗霭剑，等．马流感病毒NP基因的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立[J]．中国兽医科学，2017，47（10）：1 221-1 226.

　　[7]贺笋，任立松，李延涛，等．马流感病毒H3N8亚型的融合蛋白及其制备方法，应用和疫苗：CN201811095817.6[P].2021-06-25.