摘要：建立顶空气相色谱法，同时测定雌二醇中的残留溶剂甲醇和乙醇。采用以6%氰丙基和94%二甲基聚硅氧烷为固定相的毛细管柱作为色谱柱，用氢火焰离子化检测器检测。方法学验证结果表明：甲醇质量浓度为2.01～20.1μg/mL时残留溶剂线性关系良好（r=0.999 8），乙醇质量浓度为2.00～24.0μg/mL时残留溶剂线性关系良好（r=0.999 8）；甲醇回收率分别为106.9%、102.2%、100.8%，乙醇回收率为104.3%、103.8%、105.9%。该方法专属性强、灵敏度高、准确性好，可用于雌二醇中残留溶剂的测定。

　　关键词：雌二醇；残留溶剂；气相色谱

　　雌二醇属于甾醇类激素，是反映人体健康状况的重要指标[1]，广泛用于女性性功能疾病、更年期综合征[2]、骨质疏松[3]、纤维化[4]、神经细胞[5]等疾病的治疗，对于维护心血管系统[6]、预防射线、促进脂质代谢[7]非常有利。

　　残留溶剂是原料药制备工艺所不可避免的关键因素，若残留溶剂高于安全范围，其就会对人体造成危害。《中国药典》尚未收载对雌二醇残留溶剂的测定。雌二醇合成工艺复杂，其主要残留溶剂为甲醇和乙醇。根据残留溶剂指导原则，甲醇和乙醇分别属于二类溶剂和三类溶剂。二类溶剂为非遗传毒性致癌（动物实验）试剂或可能导致其他不可逆毒性（如神经毒性或致畸性）的试剂，三类溶液为对人体低毒的溶剂，二者应被限制使用[8-9]。由此可见，为了保证雌二醇制剂的安全性，建立对于雌二醇中残留溶剂的测定方法具有重要意义。

　　1仪器与试药

　　1.1仪器

　　Agilent 7890A型气相色谱仪；氢火焰离子化检测器（FID）；Mettler XP205型电子分析天平。

　　1.2试药

　　甲醇（国药集团化学试剂有限公司，批号：20200105，纯度：99.5%），乙醇（国药集团化学试剂有限公司，批号：20200217，纯度：99.7%），二甲基亚砜（Merck，批号：K53179600，纯度：100%）。

　　2方法与结果

　　2.1色谱条件与系统适用性试验

　　色谱柱：采用以6%氰丙基和94%二甲基聚硅氧烷为固定相的毛细管柱；程序升温：初始温度40℃,保持10 min，以5℃/min的速率升温至200°C，保持5 min；运行55 min；进样器温度140°C；检测器温度250°C；定量环温度125°C；传输线温度150°C；载气为氦气；分流模式，分流流速约25 mL/min。顶空瓶平衡温度为80°C；平衡时间30 min；加压时间0.1 min；定量环填充时间0.2 min；定量环平衡时间0.05 min；进样时间1 min；振摇为低。

　　系统适用性试验：取系统适用性溶液进样，各组分色谱峰间的分离度均符合要求，甲醇和乙醇的分离度为2.14，色谱图见图1。

　　2.2溶液制备

　　2.2.1稀释剂

　　50%二甲基亚砜溶液（二甲基亚砜-水（1:1）溶液）

　　2.2.2对照品溶液

　　称取适量甲醇、乙醇，精密称定，用50%二甲基亚砜溶液定量稀释成每1 mL含20μg、200μg甲醇的混合对照品溶液，精密量取5 mL置于顶空瓶中，密封，即得。

　　2.2.3供试品溶液

　　取本品约50 mg，精密称定，置顶空瓶中，精密加入50%二甲基亚砜溶液5.0 mL溶解，密封，摇匀。

　　2.3方法学考察

　　2.3.1专属性考察

　　取2.2项下稀释剂（空白溶液）、对照品溶液和供试品溶液，分别精密量取5 mL置于顶空瓶中，密封，即得。结果表明，空白溶液在各溶剂出峰处未受干扰，证明该方法专属性良好。

　　2.3.2线性关系考察

　　精密量取甲醇、乙醇适量，制成甲醇含量200μg/mL、乙醇含量200μg/mL的对照品储备液。分别精密量取甲醇储备液1.0 mL、0.9 mL、0.8 mL、0.7 mL、0.5 mL、0.2 mL、0.1 mL，乙醇储备液1.2 mL、1.0 mL、0.8 mL、0.5 mL、0.4 mL、0.2 mL、0.1 mL，置于同一10 mL量瓶中，用50%二甲基亚砜溶液稀释至刻度，摇匀，分别作为线性①-⑦溶液。精密量取上述7个线性溶液，顶空进样，记录色谱图。以浓度对主峰面积作标准曲线，结果如表1。

　　结果表明，甲醇质量浓度为2.01～20.1μg/mL时线性关系良好，乙醇质量浓度为2.00～24.0μg/mL时线性关系良好。

　　2.3.3重复性考察

　　取雌二醇原料药1批，参照2.2.2项下方法平行制备供试品溶液6份，按拟定条件测定。结果甲醇、乙醇均有检出，甲醇平均检出量为80 mg/L，SRSD为7.1%（n=6）；乙醇平均检出量为290 mg/L，SRSD为5.0%（n=6）。表明该方法重复性良好。

　　2.3.4加样回收率考察

　　分别称取甲醇、乙醇适量，配制成甲醇质量浓度为2.01 mg/mL、乙醇质量浓度为20.05 mg/mL的混合储备液。精密称取残留溶剂量的原料药0.5 g，共9份，各置于顶空瓶中，分别精密加入上述混合储备液0.8 mL、0.8 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.0 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.2 mL、1.2 mL，制成80%、100%、120%的低、中、高浓度，顶空进样。结果见表2。

　　2.3.5检测限与定量限

　　精密量取对照品储备液适量，作系列稀释，甲醇、乙醇的检测限分别为0.002%、0.003%；甲醇、乙醇的定量限分别为0.000 5%、0.000 8%。

　　3讨论

　　目前，雌二醇在2020版《中国药典》中有所收载，但其残留溶剂检查项仍未被订入标准。本文通过一系列摸索，建立了有关雌二醇中残留溶剂甲醇、乙醇的气相分析方法，完善了雌二醇原料药的质量标准，更充分地保证了用药安全性。

　　根据ICH《Q3C(R8)：杂质：残留溶剂》和《中国药典》中的控制标准[9]，甲醇、乙醇的限度规定分别为0.3%和0.5%。通过对3批样品进行检测，甲醇和乙醇的检测结果均小于0.1%。方法学验证的试验结果表明，该方法的检测限及定量限在该浓度下的信噪比均符合要求，定量限小于报告限度的0.5倍（相当于供试品0.05%），线性关系良好，且能被准确检测，专属性强、灵敏度高、准确性好。因此该方法适用于雌二醇原料药中残留溶剂的测定。

　　溶剂二甲基亚砜的纯度达到了色谱纯及以上级别。由于甲醇、乙醇容易受溶剂中的杂质峰干扰，故要求二甲基亚砜的纯度要尽可能高。研究发现，分析纯二甲基亚砜在甲醇、乙醇附近存在杂质峰干扰，且与二甲基亚砜的分离度不足1.0；此外，受工艺限制，二甲基亚砜在甲醇峰附近也存在残留的干扰，导致测定结果存在偏差。在改用Merck公司色谱纯二甲基亚砜后，对甲醇、乙醇存在干扰的杂质峰均不明显，表明溶剂来源对该方法的测定影响较大。

　　参考文献

　　［1］王一恺.雌二醇偶联碱性磷酸酶工艺改进［J］.生物化工,2022,8(2):1-6,11.

　　［2］钱彩英,赵俊红.17-β-雌二醇治疗更年期综合征［J］.中国新药与临床杂志,2002(4):199-201.

　　［3］QUIGLEY ME,MARTIN PL,BURNIER AM,et al.Estrogen therapy arrests bone loss in elderly women［J］.American Journal of Obstetrics&Gynecology,1987,156(6):1516-1523.

　　［4］李东,李兵顺,刘金星,等.雌二醇抗肝纤维化的实验研究［J］.中华消化杂志,2002,(10):55-56.

　　［5］PICAZO O,AZCOITIA I,GARCIA-SEGURA LM.Neuroprotective and neurotoxic effects of estrogens［J］.Brain Research,2003,990(1-2):20-27.

　　［6］付晓东,谈智,李永勇,等.17-β-雌二醇对血管内皮细胞增殖的影响［J］.中山大学学报(医学科学版),2003(5):417-420.

　　［7］朱英坚.雌激素受体(ER)、雄激素受体(AR)与前列腺癌［J］.国外医学.泌尿系统分册,2002(5):283-286.

　　［8］周海钧.药品注册的国际技术要求:质量部分［M］.北京:人民卫生出版社,2006.

　　［9］国家药典委员会.中华人民共和国药典(四部)［M］.北京:中国医药科技出版社,2020.