摘  要：从某对虾养殖池塘采集的底泥中筛出一株菌株 MF1，经 16S rDNA 鉴定为 Klebsiella michiganensis（密歇根克雷伯氏菌）。各菌株生长特性试验表明：氨氮培养基中菌株 MF1 的最适碳源 为丙酮酸钠。在温度 30 ℃、pH 7、转速 100 r/min 及 C/N 比例为 10 的条件下，菌株 MF1 的脱氮效率 达到最大值。

　　关键词：异养硝化-好氧反硝化细菌；脱氮；生长特性；环境因素

　　高密度和集约化的养殖活动导致了养殖水体中 氨氮过度积累[1] 。氨氮的大量积累不仅导致水体富 营养化和生态环境的破坏，还严重影响水质，危及水 生动物的生命安全。研究人员发现了一些异养细菌， 它们拥有异养硝化和好氧反硝化的特性，能更快速 地处理氨氮，甚至比硝化细菌更为高效[2] 。异养硝 化-好氧反硝化（HN-AD）细菌是一种同时能在异养 条件下进行硝化和在好氧条件下进行反硝化的微生 物[3] 。在 HN-AD 过程中，细菌首先将有机氮或铵盐 转化为硝酸盐，然后在好氧条件下将硝酸盐还原为 氮气。由于其简化和高效的特性，利用 HN-AD 细菌 的污水处理技术在设计和操作成本上具有明显优势 [4]。为了解决养殖中氨氮去除的问题，寻找本土的 HN-AD 细菌变得尤为重要。本文旨在从养殖沉积 物中找到这种菌群，优化其处理效果，为其在调控和 净化养殖水体中的应用提供实验基础和理论支持。

　　1   材料与方法

　　1.1   样本来源

　　从天津市某对虾养殖池塘中采集底泥样本，放 入密封袋中 0 ℃运输至天津农学院重点实验室，-80 ℃冷冻保存，用于分离菌株。

　　1.2   反硝化细菌 MF1 的分离、筛选和鉴定

　　将底泥样品转移至装有 100 mL 无菌 LB 液体 培养基的锥形瓶中，摇匀以获得均匀的悬浮液，放置 于恒温水域摇床上，以 25 ℃、100 r/min 的条件培养 24 h 后，取 0.1 mL 菌液涂布于 BTB 固体培养基上， 稀释系数范围为 8~12 次方。将培养基放入培养箱 中至少培养 24 h，并根据菌落的状态进行观察[5]。选 取目标菌落，对其进行纯化，连续进行 3 次，每次间 隔 24 h。选取经纯化的蓝色或带有蓝色光晕的好氧 反硝化细菌菌落[6]，将最终筛选的菌株放入冻存管 中与 0.25 mol/L 甘油等量混合，即 1 ∶ 1（ V ∶V）比 例，后将冻存管放入-80 ℃冰箱中进行保存，供下一 步分析[7]。

　　1.3   单因素实验优化培养条件

　　单因素实验以 NH4Cl 为氮源，在不同变量（碳 源、温度、C/N 比、转速和 pH ）下进行。在碳源实验 中，丙酮酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠、DL-苹果酸被用 作唯一碳源[8] 。在 C/N 比实验中，改变碳源浓度，将 C/N 比调整为 5、10、15 和 20。在温度实验中，温度 设置为 20 ℃、25 ℃、30 ℃和 35 ℃ 。在 pH 实验中， 使用 0.1 m HCL 或 0.1 m NaOH 将初始培养基 pH  调节至 6、7、8 和 9。在转速实验中，将转速设置为 50、100、150 和 200 r/min 来改变 DO 浓度。在所有 单因素实验中，除变量外的所有其他因素都控制在最佳条件下（丙酮酸钠作为碳源，C/N 比 10，pH 7.5， 温度 27 °C，140 r/min，P/N 比 0.26）。样品离心后取 上清液测定氨氮（NH4+-N）和总氮（TN）。

　　1.4   分析方法

　　用紫外分光光度计（UH5300，HITACHI）在波长 600 nm 处测量细菌培养物的吸光度。NH4+-N、NO3--  N、NO2 --N、TN、PO43 --P 的测定采用纳氏试剂光度 法、麝香草酚分光光度法、重氮-偶氮光度法、碱性 过硫酸钾法、钼锑抗法[9] 。不同因素对目的菌株生长 影响的实验数据均以平均值±标准差（平均值±SD， n=3）表示，并且使用 Origin 2022 软件设计图表。

　　2   结果与讨论

　　2.1   菌株 MF1 的鉴定

　　从天津市某对虾养殖池塘底泥中分离出数株可 同时具有异养硝化-好氧反硝化能力的菌株。MF1  菌株，因其具有最先进的脱氮能力容量，所以被选择 用于以下分析。菌株 MF1 在琼脂平板上的菌落大小 具有以下特点：菌落大小显著，颜色淡黄色，圆形，边 缘完整，表面光滑，黏稠状，具有严格的异养特性。 采用硅基质吸附柱法从菌体样本中抽提 DNA，使用 2×Taq Master Mix 对所提取的 DNA 进行 PCR 扩 增，对扩增产物进行一代测序（双向测序）。扩增并  测序长度为 1 402 bp 的 RNA 基因片段，将其提交 至 GenBank 核苷酸数据库。BLAST 结果表明，菌株 MF1 与密歇根克雷伯氏菌亲缘关系较近，相似度高达 100%。在此基础上，利用 NJ 法（Neighbor-Joining  Algorithm）构建系统发育树，进一步鉴定菌株 MF1 为 Klebsiella michiganensis（图 1）。

　　2.2   不同环境因素对菌株 MF1 生长及脱氮性能的影响

　　2.2.1   不同碳源对菌株 MF1 生长及脱氮性能的影 响

　　如图 2，经过 24 h 不间断的培养，丙酮酸钠显 著促进菌 MF1 的生长，尤其是在第 9~12 h 之间，菌 株 MF1 进入对数生长期，且 OD600 值开始明显高于 其他碳源。同时，氨氮为唯一氮源条件下，培养基添 加不同碳源对其总氮降解率及氨氮降解率的影响如 图 2 所示，丙酮酸钠为碳源时，菌株 MF1 对总氮、氨 氮的降解率分别为 83.68%与 84.98% ，均显著高于 其他三组。

　　2.2.2   最适碳源筛选结果

　　在对碳源进行筛选的过程中，丙酮酸钠被鉴定 为菌 MF1 的最适碳源。经过生长曲线监测与脱氮性 能的定量分析，菌株 MF1 在丙酮酸钠为唯一碳源的 条件下展现最为优越的生长性能和代谢活性。总氮、 氨氮的去除效率也在丙酮酸钠条件下达到最优。

　　2.2.3   不同环境因素对菌株MF1 脱氮性能的影响

　　在最适碳源的条件下，温度对菌株 MF1 脱氮性 能的影响如图 3 所示。当温度为 30 ℃时，菌株 MF1  展现最为优越的生长性能，同时氨氮降解率、总氮降 解率最高，分别为 95.68%及 94.55%。从图3 可以看 出 C/N 比例为 20 时，菌株 MF1 的生长性能最优，在 C/N 比例为 10 时，氨氮降解率、总氮降解率最高，分 别为 95.69%及 94.4%。转速对菌株 MF1 脱氮性能的 影响，当转速为 100 r/min 时，菌株 MF1 展现最为优 越的生长性能，同时氨氮降解率、总氮降解率最高， 分别为 95.71%及 94.35%。pH 对菌株 MF1 脱氮性能的影响，当 pH 为 7 时，菌株 MF1 展现最为优越的 生长性能，同时氨氮降解率、总氮降解率最高，分别 为 95.73%及 94.20%。

　　2.2.4   菌株 MF1 脱氮性能的影响因素

　　温度 30 °C 为菌株 MF1 的最佳生长温度，并且 在此温度下脱氮性能达到最佳，说明 MF1 在适中的 温度下活性最高，这可能与其酶活性和细胞代谢的 最佳状态有关。菌株 MF1 在中性 pH 下展现最佳的 生长和脱氮性能。这表明 MF1 可能是一个中性菌， 中性环境有利于其酶的活性和细胞生长。转速为 100 r/min 时，菌株 MF1 的脱氮性能最佳。C/N 比例 为 20 时，生长性能最优，为了达到最佳的脱氮性能， 需要 C/N 比例为 10。

　　3   结论

　　从某对虾养殖池塘采集的底泥中筛出一株菌株 MF1 ，经 16S rDNA 鉴定为 Klebsiella michiganensis（密歇根克雷伯氏菌）。各菌株生长至 24 h 左右时达 到稳定，至 24 h 氨氮培养基中菌株 MF1 脱氮反应 结束，丙酮酸钠对菌株 MF1 生长及脱氮性能的促进 效果最好。菌株 MF1 的脱氮性能与环境因素密切相 关。菌株 MF1 在温度 30 ℃、pH7、转速 100 r/min 及 C/N 比例为 10 的条件下表现最佳的脱氮性能。

　　参  考  文  献

　　［1］ 李波, 姜艳霞, 王红兵, 等. 硝化 - 反硝化细菌在循环 水高密度养殖中脱氮应用进展［J］. 水产养殖, 2023, 44 (6): 28-32.

　　［2］ PENGFEI H, XUELIANG S, ZHANMING F, et al. Simul- taneous removal of phosphorous and nitrogen by ammoni- um assimilation and aerobic denitrification of novel phos- phate-accumulating organism Pseudomonas chloritidismu- tans K14［J］. Bioresource Technology, 2021, 340: 125621.

　　［3］ 李心专. 异养硝化 - 好氧反硝化菌的筛选及脱氮特性 研究［D］. 泰安: 山东农业大学, 2023.

　　［4］ WANG L, FU Y T, WANG S J, et al. Domesticating a Halotolerant Bacterium of Vibrio sp. LY1024 with Het- erotrophic Nitrification-Aerobic Denitrification Property for Efficient Nitrogen Removal in Mariculture Wastewater Treatment［J］. Coatings, 2022, 12(11): 1786-1786.

　　［5］ 胡丹. 一株异养硝化 - 好氧反硝化细菌的分离鉴定及 脱氮特性研究［D］. 长沙: 湖南农业大学, 2023.

　　［6］ 孙巍, 夏春雨, 李长秀, 等. 异养硝化 - 好氧反硝化复 合菌剂的固定化与脱氮性能研究［J］. 广东石油化工学 院学报, 2022, 32(3): 35-40.

　　［7］ 刘丽珂. 异养硝化—好氧反硝化菌的筛选及其脱氮性 能研究［D］. 武汉: 华中农业大学, 2023.

　　［8］ 侯鹏飞. 反硝化聚磷菌 Pseudomonas chloritidismutans K14 的脱氮除磷特性及应用潜力初步研究［D］. 天津: 天津农学院, 2023.

　　［9］ JINGANG H, QI S, CHUNQIAO X, et al. Removal of am- monia nitrogen from residual ammonium leaching solution by heterotrophic nitrification-aerobic denitrification pro- cess［J］. Environmental technology, 2022, 44(23): 31-36.