摘  要：乳酸菌因其可以增强免疫力、促进消化、降低血清胆固醇等多种生理功能而受到了广泛关 注。为进一步提升发酵乳酸菌的增殖密度，本实验以植物乳杆菌 AR307 为试验对象，MRS 培养基为 基础培养基，采用单因素及响应面试验设计对培养基进行优化。研究碳源、氮源、无机盐对菌株生长 的影响，以 OD600 为评价指标确定最佳配比。结果表明：最优碳源为麦芽糖，添加量为3.5%；最优氮 源为酵母浸粉、酪蛋白胨与牛肉浸出粉，比例为 1 ∶ 1 ∶ 1，添加量为 2.21%；最优无机盐为磷酸氢二 钾，添加量为0.75%。在此优化条件下，静置发酵 24 h，植物乳杆菌 AR307 的 OD600 值达到了 6.4，菌 体密度得到了提升，为 AR307 工业化发酵提供了理论依据。

　　关键词：植物乳杆菌；培养基优化；响应面

　　乳酸菌能够用于生产酸乳、乳酪、风味泡菜、发 酵饮料等具有保健功能的食品。植物乳杆菌作为一 种常见乳酸菌，因其抗衰老、减轻肠道生态平衡[1]等 功能而愈发受消费者重视与喜爱了[2]。植物乳杆菌 （Lactobacillus plantarum）为乳杆菌科乳杆菌属，不 产芽孢、兼性厌氧或厌氧、可用于食品加工产业的革 兰氏阳性菌，形状为直杆状或弯杆状[3]，是一种重要 的益生菌，具有调节动物胃肠道菌群平衡、改善肠道 内环境、增强免疫力和抵抗力等多种功能[4-6]。近年 来，植物乳杆菌开始被应用于泡菜、豆腐等产品的发 酵中，有益于人体健康，已成为国内外的研究热点之一。

　　目前，有关益生菌的研究日渐增多，但将其应用 于大规模工业化生产中仍具有一定的局限性。植物 乳杆菌培养基优化研究快速发展，但其工业化应用 仍处于起步阶段。工业上常以 MRS 培养基为发酵培 养基，一些学者研究了添加缓冲盐和化学中和剂以 促进乳酸菌生长的方法[7]。Choi GH 等[8]用 OFAT 法 筛选碳源、氮源等，通过响应面实验得到菌株生物量 为 3.845 g/L，为优化培养基的 2.429 倍。Chen H 等[9] 通过优化碳源、氮源、有效因子等，得知磷酸氢二钾为促生长因子，各物质的添加量为葡萄糖 21 g/L，蛋 白胨 10 g/L，牛肉浸出粉 8 g/L，酵母浸出粉 8 g/L， 磷酸氢二钾 3.5 g/L，CH3COONa 6.5 g/L，C6H14O7N2 2 g/L，MgSO4 0.2 g/L，吐温 80 1 mL/L 时，最大活菌数 可以达到 2.72×109 CFU/mL。孙雨佳等通过单因素、 爬坡实验 与 中心组合实验确定 了植物乳杆菌 NCU137 最佳培养基的成分为麦芽糖 26.73 g/L，酵 母浸粉 21.8 g/L，大豆蛋白胨 16.59 g/L，MgSO4 ·7H2O 0.15 g/L，MnSO4 ·H2O 0.06 g/L，腺嘌呤 0.13 g/L，苯丙 氨酸 0.051 g/L，吐温 80 为 1 mL/L，最终活菌数高达 9.2×109 CFU/mL。植物乳杆菌 AR307 是上海理工大 学食品微生物工程技术研究中心实验室从四川泡菜 中筛获的一种乳酸菌，具有降血糖、抑制肿瘤、抑制 α-淀粉酶等作用。根据植物乳杆菌 AR307 的生长需 求，调整 MRS 培养基碳源、氮源、无机盐的含量进行 单因素实验、Box-Behnken 试验，旨在提高植物乳杆 菌 AR307 的菌体密度，为 AR307 产业化、工业化大 剂量发酵提供理论依据[10]。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与仪器.

　　植物乳杆菌AR307，由上海理工大学食品微生物工程技术研究中心保藏；MRS培养基：酪蛋白胨10 g/L，牛肉浸出粉10 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸镁0.1 g/L，乙酸钠8.3 g/L，柠檬酸氢二铵2 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，吐温80 1 mL/L;MRS固体培养基：在液体培养基的基础上加入20.0 g/L的琼脂；果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、低聚木糖、木糖、海藻糖、壳寡糖、淀粉、抗性糊精、菊粉、胰蛋白胨。

　　PL2002型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；SW-CJ-1D型单人净化工作台，苏州净化设备有限公司；酶标仪，奥地利美谷分子；DU-800分光光度计，Beckman公司；Ruskinn低氧厌氧培养工作站，英国Ruskinn；BPH-G082型精密恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；Bioscreen C全自动生长曲线分析仪，芬兰Oy Growth Curves Ab公司；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂。

　　1.2菌株培养

　　将于-80℃保藏的植物乳杆菌AR307在固体MRS培养基上划线培养，在37℃恒温培养箱中培养24~48 h后，挑取单菌落于液体MRS培养基中，于37℃恒温培养箱中培养16~18 h后，以1%的比例接种于优化培养基中培养。

　　1.3发酵培养基优化

　　分别选择不同的碳源、氮源、无机盐作为影响菌株活性的主要因素，通过单因素试验选择影响因素与水平。

　　1.3.1最佳碳源的确定

　　在MRS培养基中分别加入2%的果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖麦芽糖低聚木糖、木糖、海藻糖、壳聚、淀粉、抗性糊精、菊粉、葡萄糖，研究不同种类的碳源对植物乳杆菌AR307生长的影响筛选出最佳碳源后选择不同浓度的碳源加入MRS，研究碳源浓度对菌株的影响菌株接种量均为1%37℃培养24 h，生长曲线仪测定菌体的OD600。

　　1.3.2最佳氮源的确定

　　在MRS培养基中分别添加酵母浸粉、牛肉浸粉、胰蛋白胨、酪蛋白胨，研究不同氮源对植物乳杆菌AR307生长的影响，又研究了复配氮源及不同浓度的氮源对菌株生长的影响，菌株接种量均为1%，37℃培养24 h，生长曲线仪测定菌体的OD600。

　　1.3.3无机盐的确定

　　在MRS培养基中分别加入磷酸氢二钾、七水硫酸镁、三水乙酸钠、柠檬酸氢二铵，研究不同无机盐对植物乳杆菌AR307生长的影响，又研究了复配无机盐及不同浓度的无机盐对菌株生长的影响，菌株接种量均为1%，37℃培养24 h，生长曲线仪测定菌体的OD600。

　　1.4 BOX-Behnken响应面实验

　　响应面设计（Box-Behnken）原理，选取对植物乳杆菌AR307生长影响较大的单因素碳源、氮源、无机盐为自变量，以OD600（分光光度计）为响应值，得到其在各个影响因素下的最大值，设计响应面实验，以确定植物乳杆菌AR307生长的培养基成分，实验因素与水平设计见表1。

　　2结果与分析

　　2.1碳源对菌株生长的影响

　　碳源作为微生物生长过程中重要的营养物质，可以为乳酸菌生长提供能量，加快物质向细胞的传输速度，加快细胞的合成和新陈代谢，促进乳酸菌的快速增殖[11]。不同碳源对植物乳杆菌AR307生长与产生的影响如图1（a）所示，在以麦芽糖为碳源时，AR307生长最快，OD600在培养至12 h时达到1.6，这与董子兴等[12]的研究结果一致，菌株对壳聚糖、木糖、淀粉、抗性糊精等的利用率较低，几乎不生长，因此确定麦芽糖为最佳碳源。接下来，对麦芽糖的添加量进行探究，如图1（b）所示，结果发现随着添加量的增加，菌体密度逐渐增加，在麦芽糖浓度为3%后呈下降趋势，这可能由于碳源浓度过高，抑制了植物乳杆菌AR307的生长，最终选取2.5%、3%、3.5%作为响应面的三个浓度。

　　2.2氮源对菌株生长的影响

　　氮源作为微生物生长的重要营养素，主要用于蛋白质、氨基酸、核酸和辅酶等物质的合成[13]。蛋白胨含有丰富的氨基酸，特别是含硫氨基酸较多，还含有细菌生长所需的维生素和其他生长因子，是各种培养基制备的基础原材料，主要作用是提供氮源。本研究将MRS培养基中的氮源替换为酵母浸粉、牛肉浸出粉、胰蛋白胨、酪蛋白胨及复合氮源，发酵24 h，测定其生长曲线，探究不同氮源对植物乳杆菌生长的影响。如图2（a）所示，添加单一氮源酵母浸粉、牛肉浸出粉、酪蛋白胨的效果与添加复合氮源的效果存在一定的差异，例如单纯添加胰蛋白胨可以抑制菌株生长，但复合氮源可以促进菌体生长，因此考虑对几种氮源进行复配使用，既可以满足菌体生长的需求，又可以降低成本，取得更好的效果[14]。当酵母浸粉、牛肉浸出粉、酪蛋白胨的添加比例为1∶1∶1时最有利于植物乳杆菌生长。接下来，对复合氮源的添加量进行探究，结果如图 2（b）所示，随着 氮源添加量的增加，菌体密度逐渐增加，当氮源添加 量为 1.5%时，菌体密度达到 1.63；但当添加量超过 1.5%时，菌体密度降低。这可能是由于植物乳杆菌 在生长过程中需要足够的氮源，浓度较低营养不充 分会影响其生长，但浓度过高又会使有机酸不断积 累从而抑制菌株生长，最终选取 1.5%、2%、2.5%作 为响应面的三个浓度。

　　2.3 无机盐对菌株生长的影响

　　乳酸菌高密度培养过程补充的无机盐主要是作 为缓冲物质，来调节菌体生长过程中 pH 的变化的， 维持适宜乳酸菌生长的 pH 环境，延长发酵剂的活 性 [11]。磷酸盐在培养基中具有调节 pH 和缓冲等作 用，在 MRS 培养基中添加相同比例的单一无机盐或 复合无机盐，考察不同缓冲盐对菌株生长的影响，以  菌株生长 OD600 值的大小为标准，如图 3（a）所示，选 用磷酸氢二钾时菌体密度最大，最终确定无机离子 为磷酸氢二钾。进一步对磷酸氢二钾的添加量进行了浓度试验，结果显示随着添加量的增加，菌体密度 呈现先上升后下降的趋势如下图 3（b），最终选取 0.7%、0.8%、0.9%三个浓度开展响应面实验。

　　2.4 响应面优化试验

　　根据单因素试验的结果，以碳源添加量、氮源添 加量、无机盐添加量为影响因素，以 OD600 为响应 值，进行三因素三水平的响应面分析，进一步优化培 养基的添加比例。选取三因素的 Box-Behnken 拟合 二阶响应面三水平设计，共 17 个试验点，其中 12 个 为分析因子，5 个为零点，响应值 Y 为 OD600，试验结 果见表 2。

　　对响应面设计表进行多元二次回归拟合，建立 OD600 的回归模型如图表 3 所示。回归方程 Y=6.2+ 0.39X1 +0.088X2 +0.1X3 -0.23X1X2 +0.1X1X3 +0.1X2X3 - 0.54X12-0.29X22-0.71X32，其中 A、A2 与 C2 为极显著 差异（P<0.01）。模型拟合的决定系数（R2）和校正决 定系数（RAdj 值）分别为 0.907 2 和 0.787 9，C.V.%为 5.29<10，说明该实验的可信度和精确度较高，模型 的 P<0.01，具有显著性，失拟项 P值为 0.051 1，不显 著（P>0.05），表明模型的显著性较好，各因素对植物 乳杆菌 AR307 的影响次序为碳源>无机盐>氮源，其 中碳源的影响最大[15]。

　　图 4 是回归方程得到的曲面与等高线图，主要 反映了碳源、氮源与无机盐之间的相互作用，碳源与 无机盐对菌株 OD600 的交互效应较强，表现为响应曲面较为陡峭；碳源与氮源对菌株 OD600 的交互作 用次之；氮源与无机盐对菌株 OD600 的交互效应较 差，表现为响应曲面较为平缓。由方程可知，二项式 系数为负值，表明方程拥有最大值。利用 Design- Expert10.0 分析计算，最适发酵培养基为碳源添加 3.5%、氮源添加 2.21%、无机盐添加 0.75%，此时的 OD600 值最大为 6.4。

　　3 结论

　　本研究对植物乳杆菌 AR307 发酵培养基的组成成分及添加量进行了优化，以单因素实验与响应 面 Box-Behnken 实验建立了二次多项式回归模型。 单因素试验确定促进菌株生长的最优碳源为麦芽 糖、氮源为复合氮源、无机盐为磷酸氢二钾，由回归 方程的拟合结果得知菌株生长的最佳碳源添加量为 3.5%、氮源添加量为 2.21%、无机盐添加量为 0.75%，确定了植物乳杆菌 AR307 的最适培养基。在 此优化条件下 ，植物乳杆菌 AR307 的 OD600 值为 6.4，菌体密度得到了提升，植物乳杆菌发酵培养基 优化的研究为今后工业化生产植物乳杆菌奠定了基础，具有较好的经济效益、社会效益和发展前景。

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