摘  要：为了有效区分鉴别李斯特菌属，选择几种李斯特菌属的标准菌株，包括英诺克李斯特氏菌、 斯氏李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌，按照相同的方法进行检测。过程中对 其菌落形态、生理生化特性、溶血现象进行分析，区分不同菌株的特性，从而有效、快速地鉴别 目标 菌。染色镜检、动力试验、过氧化氢酶试验不能有效地区分李斯特菌属，生化鉴定及溶血试验可以有 效区分。不同标准菌株之间的对比试验可有效鉴别目标菌。

　　关键词：李斯特菌；溶血；鉴别；VITEK 2 Compact

　　单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌（Listeria monocytogenes）常出现于土壤中，是以死亡的和正在 腐烂的有机物为食的腐生菌，能产生溶血素，引起人 类发烧、腹泻、头痛、发冷、恶心、肌痛等症状，也是肉 制品、乳制品、鱼类、冷藏类食品中的一种污染物，感 染后主要表现为败血症、脑膜炎，对人类健康危害较大。

　　对于单增李斯特氏菌，检验技术机构采用国家 标准法作为基础方法进行检验。如何有效地鉴别单 核细胞增生李斯特菌，则需要与其他相似菌进行对 比试验，在试验过程中记录生理生化试验结果的相 同点及不同点，从而准确快速地分辨单核细胞增生李斯特菌。

　　从 2021 年开始，本实验室陆续购入李斯特菌属 的标准菌株：英诺克李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、 伊氏李斯特氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌。依据 GB 4789.30-2016《食品安全国家标准 食品微生物 学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》[1]，人为地将 李斯特菌属的标准菌株添加至样品中，在连续的试 验中观察对应标准菌株的菌落形态、生化及溶血试 验，从而找出不同菌株的差异性，提升实验人员的综 合水平。

　　1  材料与方法

　　1.1  菌株与培养基

　　标准菌株：伊氏李斯特氏菌 ATCC19119[美国菌 种 保 藏 中 心 （American type culture collection， ATCC）]、斯氏李斯特氏菌 CICC35967、英诺克李斯 特氏菌 CICC10417、单增李斯特氏菌 CICC21635[中 国工业微生物菌种保藏管理中心（ China center of industrial culture collection，CICC）]。

　　含 0.6%酵母膏的胰酪胨大豆肉汤（Trypticase Soy-Yeast Extract Agar，TSA-YE）、BHI 肉汤（Brain Heart Infusion Broth）、血琼脂平板、PALCAM 琼脂基 础（PALCAM Agar Base）、李斯特氏菌显色培养基 （Listeria Chiomogenic Medium）、 半 固 体 培 养 基 （Motility Test Medium（Semisolid））、单增李斯特氏菌 干 制 生 化 鉴 定 试 剂 盒 （Listeria Monocytogenes Dehydration Biochemical Identification Kit）、3%过氧 化氢溶液、PALCAM 选择性添加剂、革兰氏染色液 （GRAM STAIN SETS）试剂盒。以上培养基均来源于 北京陆桥技术股份有限公司。

　　1.2  仪器

　　BSP-250 生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、SPX-250B 生化培养箱（上海福玛实 验设备有限公司）、BSC-1300ⅡA2 生物安全柜（上 海博迅实业有限公司医疗设备厂）、培养皿（玻璃培 养皿或一次性培养皿）、18 mm×180 mm 试管、接种 针及对应的灭菌装置（如酒精灯或红外灭菌器）、 Primo Star 显微镜（卡尔蔡司股份公司）、VITEK 2 COMPACT 微生物鉴定仪（法国生物梅里埃公司）。

　　1.3  实验方法

　　参照 GB 4789.30-2016《食品安全国家标准 食 品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》方 法。

　　1.3.1  菌种的活化

　　标准菌株需从专业从事微生物菌种保藏管理的 机构处获得，严格按照标准菌株附带的操作流程活 化。实验室按照相应的操作流程将菌株活化后，将 其保存在营养肉汤中，同时添加 10%~15%的甘油作 为冷冻保护培养基[2]，获得标准储备菌株，并将其贮 存在（-20±2）℃的专用冰柜中。

　　1.3.2  菌种的复活

　　将上述活化后的菌株取出，分别放置在营养肉  汤或 BHI 肉汤（Brain Heart Infusion Broth）中（36±1） ℃培养 18~24 h。

　　1.3.3  划线分离与纯化

　　使 用 李 斯 特 氏 菌 显 色 培 养 基（Listeria Chiomogenic Medium）和 PALCAM 琼脂基础（PAL- CAM Agar Base）划线培养后的营养肉汤或 BHI 肉 汤，于（36±1）℃培养（24±2）h 后，观察菌落形态。同 时将上述平板上的菌落划线纯化至 TSA-YE 平板 上，进行后续的鉴定实验。

　　1.3.4  鉴定

　　①染色镜检；②动力试验；③生化鉴定：用 3% 过氧化氢溶液及干制生化试剂盒鉴定，生化试剂盒 包含木糖、鼠李糖、MR-VP、葡萄糖、麦芽糖、甘露 醇、七叶苷；④溶血试验：穿刺接种；⑤使用VITEK 2 COMPACT 微生物鉴定仪进行鉴定[3]。

　　2  结果与分析

　　2.1  分离与纯化

　　不同菌株在相应培养基上的菌落形态见表 1。 由于试验过程中使用非选择性增菌培养基 TSA-YE，故在 TSA-YE 生长的菌株均为乳白色，从菌落 形态上无法进行区分。

　　2.2  鉴定

　　2.2.1  染色镜检

　　挑取 TSA-YE 平板上的菌落进行染色镜检见 图 1。镜检结果表示，四种标准菌株均为革兰氏阳性 短杆菌。

　　2.2.2  动力试验

　　使用接种针将 TSA-YE 平板上的菌落穿刺至 半固体培养基中，于（30±1）℃培养 48 h~5 d。半固 体生长状态见图 2。

　　2.2.3  生化鉴定

　　生化鉴定结果见表 2，MR-VP、葡萄糖、麦芽糖、 七叶苷、过氧化氢酶试验无法区分斯氏李斯特氏菌 CICC35967、英诺克李斯特氏菌 CICC10417、伊氏李 斯特氏菌 ATCC19119、单增李斯特氏菌 CICC21635 四种菌株。伊氏李斯特氏菌 ATCC19119、斯氏李斯 特氏菌 CICC35967 鼠李糖和木糖的结果分别为 （-）、（+），英诺克李斯特氏菌 CICC10417、单增李斯 特氏菌 CICC21635 鼠李糖和木糖的结果分别为 （+）、（-），这两个试验可进行有效区分。

　　2.2.4  溶血试验

　　单增李斯特氏菌产生狭窄、清晰、明亮的溶血 圈，斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生弱的透明溶 血圈，英诺克李斯特氏菌无溶血圈，伊氏李斯特氏菌 产生宽的、轮廓清晰的 β-溶血区域。

　　2.2.5  VITEK 2 COMPACT 微生物鉴定仪鉴定

　　利用VITEK 2 Compact 全自动微生物分析系统 对伊氏李斯特氏菌 ATCC19119、斯氏李斯特氏菌 CICC35967、英诺克李斯特氏菌 CICC10417、单增李 斯特氏菌 CICC21635 四种菌株进行鉴定，磷脂酰磷 脂酶 C（PIPLC）、D-木糖（dXYL）、α-葡萄糖苷酶（AGLU）、α-甘露糖苷酶（AMAN）、酪氨酸芳胺酶

　　（TyrA）、多粘菌素 B 耐受（POLYB）、乳糖（LAC）、新  生霉素耐受（NOVO）、6.5%NaCl 生长（NC6.5）、D-海  藻糖（dTRE）等 10 项检测结果不一致，其余 33 项生  化鉴定结果一致，结果分别判定为伊氏李斯特氏菌  （93%概率）为非常好的鉴定，斯氏李斯特氏菌（97%  概率）为极好的鉴定，英诺克李斯特氏菌（99%概率） 为极好的鉴定，单核细胞增生李斯特氏菌（99%概  率）为极好的鉴定。

　　3  结论

　　本研究表明，菌株的关键特性在试验中可快速、 高效的区分与分离，同时木糖和鼠李糖试验可初步 筛选区分 4 株标准菌株。未来可以通过科学技术，将 木糖和鼠李糖加入鉴别培养基中，在划线分离步骤 中通过颜色信息进行区分，缩短试验过程，提高检测 效率。

　　参  考  文  献

　　［1］ 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会,国家食品 药品监督管理总局. 食品安全国家标准 食品微生物学 检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验: GB 4789.30-2016 ［S］. 北京: 中国标准出版社, 2016.

　　［2］ 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全 国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要 求: GB 4789.28-2013［S］. 北京: 中国标准出版社, 2013.

　　［3］ 贺炎娜, 范丽丽, 张琦, 等. 利用选择性培养基快速初步 鉴定食品中的致病微生物［J］. 食品安全质量检测学报, 2020, 11(1): 258-261.