摘  要：作为一种新兴第二信使分子，c-di-AMP具有全局调控胞内渗透压平衡、DNA 损伤和生物 膜形成等生理功能。本实验室在实验前期筛选出了一株高产胞外多糖的嗜热链球菌菌株 S-3，但未 对其进行 c-di-AMP信号通路研究。本研究在嗜热链球菌 S-3 全基因组中筛选出c-di-AMP 合成 酶（StDAC），对其二级结构进行预测，结果显示 StDAC 二级结构包含 42.98%α-螺旋、15.32%β-折叠 和 38.30%无规则卷曲。利用 SWISS-MODEL和 Modeller 对 StDAC 进行单模板和多模板同源建模， 由 SWISS-MODEL 建立的模型通过了 Ramachandran、Errat 和 Verify-3D 评估，表明其结构较为合 理；而 Modeller 建立的模型仅通过了 Ramachandran 评估，总体结构评分较低。本研究预测的嗜热链 球菌 StDAC 三维模型为解析其结构和功能奠定了基础。

　　关键词：嗜热链球菌；c-di-AMP；生物信息学；二级结构；同源建模

　　嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）是一种 革兰氏阳性菌，也是一种公认的食品安全菌株，被广 泛应用于酸奶和奶酪等传统乳制品的生产过程中[1- 2]。为适应乳制品发酵过程中的酸性环境，感知细胞 外的信号并用信使分子来传递信号，对嗜热链球菌 的生存尤为重要。第二信使分子 c-di-AMP 广泛存 在于细菌、古生菌尤其是厚壁菌门中，与脂肪酸代 谢、钾离子稳态、渗透压调节、细胞毒力以及生物膜 形成等多种生理功能密切相关 [3-8]。为阐明 c-di- AMP 在嗜热链球菌中的调控机制，研究 c-di-AMP 合成酶的结构与功能非常有必要。细菌 c-di-AMP 合成酶 DAC 包含一个高度保守的 DAC/DisA_N 结 构域，可催化 ATP 或 ADP 合成 c-di-AMP。DAC 蛋 白活性与保守的 DGA（Asp-Gly-Ala）和 RHR（Arg- His-Arg）基序密切相关[9-12]。DAC 催化 c-di-AMP 合 成需要辅因子二价金属离子，用 DAC 三级结构可以预测可能的辅因子和关键结合位点[13]。

　　本实验室在实验前期在传统乳制品中筛选出了 一株高产胞外多糖的嗜热链球菌菌株 S-3，并对其 进行了全基因组测序[14]。结合 HMMER 预测和 NCBI 数据库比对在嗜热链球菌 S-3 基因组中预测出的 c-di-AMP 合成酶（命名为 StDAC），对其跨膜区和 二级结构进行预测 ，并通过 SWISS-MODEL 和 Modeller 进行三级结构模拟，为后续探究 StDAC 的 结构与功能奠定基础。

　　1 方法

　　1.1 二级结构预测

　　将 StDAC 氨基酸序列提交至蛋白质序列网络 分析 在线软 件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat.plpage=/NPSA/npsa_server.html），选择 其中 9 个有代表性的二级结构预测方法：SOPM，HNN，MLRC，DPM，DSC，GOR   Ⅰ   , GOR   Ⅲ   , PHD ， Predator 对 StDAC 二级结构进行预测 [15 -16] 。其中   HNN，MLRC，DSC，GORⅢ , PHD，Predator 为三态定   义法，“h ”代表α-螺旋、“e”代表 β-折叠、“c ”代表无   规则卷曲；SOPM，DPM 和 GOR Ⅰ为四态定义法，“h ” 代表α-螺旋、“e ”代表 β-折叠、“c”代表无规则卷   曲、“t ”代表 β-转角。为统一标准采用三态定义法对   二级结构进行比较分析。

　　1.2   SWISS-MODEL 单模板建模

　　将 StDAC 氨基酸序列提交至 SWISS-MODEL  蛋白分子建模服务器（https://swissmodel.expasy.org/） 进行单模板建模，返回 GMQE 值小于 1 且接近 1、 QMENA 值接近 0、氨基酸同源性大于 30%模板的  pdb 格式。建立的模型通过 Discovery studio 可视化  即可模拟 StDAC 三级结构[17] 。建模模板来自于美国  国 家 生 物 技 术 信 息 中 心 （National  Center  of  Biotechnology  Information，NCBI） 的 Structure 数据  库。

　　1.3   Modeller   多模板建模

　　将 StDAC 氨基酸序列提交至 Blast（https://blast.  ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）、Phyre2（http://www.sbg.  bio . ic . ac . uk / phyre2 / html / page . cgi? id = index）和  HHpred（https://toolkit.tuebingen.mpg.de/tools/hhpred） 在线数据库，搜索与 StDAC 具有同源性的模板。将  氨基酸同源性与软件评分较高的单模板依次通过脚  本 salign.py，align2d_mult.py 和 model_mult.py 进行  多模板建模，返回的 pdb 文件通过 Discovery studio  可视化即可模拟 StDAC 三级结构。

　　1.4   模型评估

　　将预测 的模 型提交 至 SAVES 在线 服务器 （https://saves.mbi.ucla.edu/）， 根 据 提 示 分 别 对 Verify-3D，Errat 和 PROCHECK 中 Ramachandran 图 对模型的 3D 结构、晶体学和生理化学参数进行评 估。

　　2   结果分析与讨论

　　2.1   c-di-AMP 合成酶预测

　　利用 HMMER 预测和 NCBI 数据库比对在嗜热 链球菌 S-3 全基因组中发现的一个编码 DisA_N 结 构域的 c-di-AMP 合成酶基因（orf0696），将其编码的蛋白命名为StDAC。StDAC 分别与已报道的枯草 芽孢杆菌 c -di-AMP 合成酶 CdaA 和 DisA 拥有 47%和 33%的氨基酸序列相似性[10,18] 。用 PROTTER  在线分析软件对 StDAC 跨膜区进行预测，结果显示 StDAC 的第 7~52 个氨基酸为跨膜区，第 1~6 个氨 基酸和第 53~235 个氨基酸位于膜内侧。跨膜区预 测结果为 StDAC 异源表达提供了借鉴，可通过切除 第 7~52 个氨基酸提高可溶性蛋白含量。如图 1 所示。

　　2.2   StDAC 二级结构预测

　　二级结构预测方法通常基于统计经验算法 （MLRC、DPM、GOR  Ⅰ 、GOR Ⅲ )、物 理 化学 算 法 （SOPM、DSC、Predator）和神经网络算法（HNN、PHD）， 这些方法预测的α-helix 的准确性高于 90%[19-20]。综 合 9 种预测方法得到的 StDAC 二级结构有 42.98%  （共 101 个氨基酸）为 α-螺旋，15.32%（共 36 个氨基 酸）为 β-折叠，38.30%（共 90 个氨基酸）（图 2）为无 规则卷曲。用物理化学算法 DSC 和神经网络算法 PHD 预测的二级结构更接近综合预测结果。如表 1  所示。

　　2.3   StDAC 三级结构建模

　　SWISS-MODEL 在线服务器选择用氨基酸同源 性最高和覆盖率最广的模板 6hvm 对 StDAC 进行单 模板建模（图 3A）。由于模板 6hvm 的晶体结构没有 跨膜区，因此 SWISS-MODEL 要对含 DisA_N 结构 域的 StDAC 从第 70~228 个氨基酸序列（共 158 个 氨基酸）进行三维建模。利用 Modeller 进行多模板建 模 ，用 NCBI、Phyre2 和 HHpred 在线数据库搜索StDAC 建模模板，以氨基酸同源性高、软件评分高和 氨基酸覆盖率广为标准，以 6gyw、6huw 和 d2fb5a1 为模板对 StDAC 进行多模板建模，如图 3B 所示。用 SWISS-MODEL 和 Modeller 两种方法建立的三级结 构都包含 5 个α-螺旋区域和 7 个 β-折叠区域，但 Modeller 建立的三级结构包括跨膜区域。

　　2.4   StDAC 三级结构评估

　　Ramachandran 图为最常见三级结构评估方法， 图中的红色区域为“最适区域”，黄色区域为“允许区域”，其他区域的红点均为构象不合理的氨基酸，合 理的三级结构须有 90%以上的氨基酸落在红色区 域 [21] 。用 SWISSMODEL 建立的 StDAC 三级结构有 92.0%的氨基酸落在最适区域，8.0%的氨基酸落在 允许区域。用 Modeller 建立的三级结构有 92.4%的 氨基酸落在最适区域，7.6%的氨基酸落在允许区 域 。 因 此 ， 两 种 方 法 建 立 的 三 级 结 构 在 Ramachandran 图评估中都不存在氨基酸构象不合 理的情况。如图4 所示。

　　Errat 通过统计和分析 0.35 nm 半径内，不同类 型原子之间非键相互作用的数据，是通过晶体学方 法评估蛋白质模型，软件评分大于 85%的模型才具 有可靠性，图中的黄线和红线越多表示三级结构的 可靠性越差[22]。由 SWISSMODEL 建立的 StDAC 三级 结构 Errat 的评分为 98.98% ，模型通过评估。而 Modeller 建立的三级结构 Errat 的评分为 78.28%， 其中跨膜区和第 180~230 个氨基酸处出现了较多的黄线和红线，构象不合理导致模型评分低，如图 5 所示。

　　Verify-3D 是基于统计分析结果来评估蛋白三 维结构与氨基酸序列的相容性的，合理的三级结构 通常有 80%以上氨基酸的相容性评分高于 0.2[23]。由 SWISSMODEL建立的StDACVerify-3D评分为84.06%， 通过评估 。而 Modeller 建立 的 StDAC 三级结构 Verify-3D 的评分为 54.04%，没有通过评估，与 Errat 的评估结果相同，跨膜区和第 180~230 个氨基酸结 构不合理导致整体结构评分较低，如图 6 所示。

　　通过 Verify -3D、Errat 和 PROCHECK 中 的 Ramachandran图对建立的 StDAC 三级结构进行评 估，评估结果表明由 SWISS-MODEL 建立的 StDAC 三级结构通过了 Ramachandran、Errat 和 Verify-3D 的评估，蛋白结构较为合理；由 Modeller 建立的全长 StDAC 三级结构仅通过了 Ramachandran 评估，三级 结构评分低。因此，可通过 SWISS-MODEL 模拟的 三级结构对 StDAC 的结构与功能进行研究。

　　3 结论

　　基于嗜热链球菌 S-3 全基因组测序结果，结合 HMMER 预测和 NCBI 数据库 比对筛选出 c-di- AMP 合成酶 StDAC。利用统计经验算法、物理化学  算法和神经网络算法共 9 种方法预测 StDAC 的二 级 结 构 42.98%为 α -螺 旋、15.32%为 β -折 叠、 38.30%为无规则卷曲。分别通过 SWISS-MODEL 和 Modeller 模 拟 StDAC 三 级 结 构 ，其 中 SWISS - MODEL 单 模 板 建 模 的 StDAC 三 级 结 构 在 PROCHECK、Verify-3D 和 Errat 三个分析软件中评 分最高，为研究 c-di-AMP 合成酶 StDAC 的结构与 功能提供了可靠的模型，并为进一步阐明嗜热链球 菌中 c-di-AMP 的调控机制奠定了基础。

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