摘要：研究建立了一种基于高效液相色谱（HPLC）结合2，4-二硝基氟苯（DNFB）衍生化的分析方法，用于定量检测透明质酸钠复合溶液的甘氨酸和丙氨酸含量。通过优化衍生化反应条件（60℃水浴振摇90 min，pH为7.0~8.0）和色谱分离参数［C18柱，0.1 mol/L醋酸钠-乙腈溶液（质量比85∶15），pH=6.85，检测波长360 nm］，实现了目标氨基酸的高灵敏度（检测限0.02 mg/mL）和高选择性（分离度≥1.5）检测。方法学验证表明，甘氨酸和丙氨酸质量浓度在0.02~0.06 mg/mL范围内线性良好（r>0.998），精密度（RSD≤0.25%）和准确度（回收率95.3%~99.3%）均符合药典要求。与传统方法相比，该方法避免了强酸或酶解步骤，具有操作简便、成本低、抗干扰能力强等优势，为透明质酸钠复合溶液的质量控制及标准化研究提供了可靠的分析手段。

　　关键词：甘氨酸；丙氨酸；衍生化反应；透明质酸钠

　　0引言

　　透明质酸钠作为一种重要的生物医用材料，因其优异的生物相容性、可降解性和保湿性能，在医疗美容、骨科修复等领域得到广泛应用。近年来，随着组织工程和再生医学的发展，透明质酸钠复合溶液作为一种新型生物材料备受关注，其通过将透明质酸钠与其他功能性成分（如氨基酸）复合，可显著改善材料的力学性能和生物活性。甘氨酸和丙氨酸作为透明质酸钠复合溶液中常用的氨基酸添加剂，不仅能够调节材料的机械强度，还能促进细胞黏附和增殖，对产品的临床应用效果具有重要影响[1]。因此，建立准确、可靠的甘氨酸和丙氨酸含量分析方法，对于透明质酸钠复合溶液的质量控制、工艺优化及标准化研究具有重要意义。然而，由于透明质酸钠复合溶液成分复杂，且甘氨酸和丙氨酸缺乏紫外吸收基团，传统分析方法往往面临灵敏度低、干扰因素多等挑战[2]。

　　目前，氨基酸分析主要采用柱前或柱后衍生化结合高效液相色谱（HPLC）的方法，其中邻苯二甲醛（OPA）、芴甲氧羰酰氯（FMOC-Cl）和2，4-二硝基氟苯（DNFB）等衍生化试剂较为常用。然而，OPA衍生物稳定性较差，FMOC-Cl衍生化步骤繁琐，而DNFB因其反应条件温和、衍生物稳定等优势，逐渐成为氨基酸分析的重要选择。但现有研究多集中于食品或生物样品中的氨基酸分析，针对透明质酸钠复合溶液这一特殊基质的分析方法尚未见系统报道。此外，传统氨基酸分析通常需要强酸水解或酶解步骤，不仅操作复杂，还可能破坏目标氨基酸，影响检测结果的准确性。

　　因此，开发一种简便、高效、抗干扰能力强的分析方法，实现透明质酸钠复合溶液甘氨酸和丙氨酸的直接测定，是当前研究的重要方向[3]。

　　研究基于高效液相色谱结合2，4-二硝基氟苯（DNFB）衍生化技术，建立了一种新型的甘氨酸和丙氨酸含量分析方法。通过系统优化衍生化反应条件（包括反应温度、时间、pH值等）和色谱分离参数（流动相组成、pH值、柱温等），显著提高了检测灵敏度和选择性[4]。与传统方法相比，本方法避免了复杂的样品前处理步骤，直接对游离氨基酸进行衍生化分析，不仅简化了操作流程，还提高了检测的准确性和重现性。研究结果表明，该方法在0.02~0.06 mg/mL质量浓度范围内线性良好（r>0.998），检测限达0.02 mg/mL，精密度（RSD≤0.25%）和准确度（回收率95.3%~99.3%）均符合药典要求。此外，方法学验证证实该方法具有较强的抗干扰能力，能够有效排除透明质酸钠基质的干扰，为透明质酸钠复合溶液的质量控制提供了可靠的技术支持。本研究的创新点在于首次将DNFB衍生化-HPLC技术应用于透明质酸钠复合溶液中氨基酸的分析，为解决该类材料质量控制中的关键技术难题提供了新思路。该方法的成功开发不仅填补了该领域的方法学空白，也为相关产品的标准化研究和临床应用奠定了坚实基础。未来，该方法可进一步拓展至其他生物材料中氨基酸的分析，具有广阔的应用前景。

　　1实验试剂与条件

　　1.1流动相制备

　　以0.1 mol/L醋酸钠溶液（称取8.2 g醋酸钠，纯化水溶解定容至1 000 mL）和乙腈按体积比85∶15进行配制，混合后用稀醋酸调节pH=6.85，抽滤，超声去除气泡，即得流动相。

　　1.2溶液制备

　　碳酸氢钠溶液（0.5 mol/L）；2，4-二硝基氟苯乙腈溶液（1→100）；磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0）。

　　1.3 0.5moLL碳酸氢钠溶液制备

　　称取碳酸氢钠4.2 g，加纯化水溶解定容至100 mL。

　　1.4 2,4二硝基氟苯乙腈溶液制备

　　移取1 mL 2，4-二硝基氟苯，加入乙腈定容至100 mL。

　　1.5磷酸盐缓冲溶液(PH=7.0)制备

　　称取磷酸二氢钾0.68 g，加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液29.1 mL，纯化水定容至100 mL。

　　1.6对照品溶液制备

　　1）精密称取甘氨酸、丙氨酸标准品各20 mg，分别加注射用水溶解并定容，制成每1 mL中含1 mg甘氨酸与1 mg丙氨酸的储备液。稀释制成每1 mL中含0.04 mg甘氨酸与0.04 mg丙氨酸的混合溶液，配制两组。

　　2）分别取上一步所得溶液2 mL，加入10 mL玻璃试管中，各加入0.5 mol/L碳酸氢钠溶液2 mL和2，4-二硝基氟苯乙腈溶液0.8 mL，混匀，将试管进行密封，60℃恒温水浴振摇90 min。

　　3）取出上一步溶液放冷，转移到10 mL容量瓶中，用PBS溶液润洗试管2~3次转移到容量瓶中并进行定容，摇匀后用0.45μm有机滤膜过滤约2 mL溶液到进样瓶中，即得对照品溶液。

　　1.7供试品溶液制备

　　1）取供试品一瓶，加入对应规格注射用水复溶，完全溶解后，转移到20 mL容量瓶中，润洗西林瓶全量转移到容量瓶中，混匀后定容，稀释为每1 mL中约含0.04 mg甘氨酸与0.04 mg丙氨酸的溶液。

　　2）取上一步所得溶液2 mL，加入10 mL玻璃试管中，加入0.5 mol/L碳酸氢钠溶液2 mL和2，4-二硝基氟苯乙腈溶液0.8 mL，混匀，将试管进行密封，60℃恒温水浴振摇90 min。

　　3）取出上一步溶液放冷，转移到10 mL容量瓶中，用PBS溶液润洗试管2~3次转移到容量瓶中并进行定容，摇匀后用0.45μm有机滤膜过滤约2 mL溶液到进样瓶中，即得供试品溶液。

　　4）精密称取注射用水2 mL于10 mL玻璃试管中，其余步骤一致，即得溶剂空白。

　　2方法与结果

　　2.1色谱条件

　　C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：V（0.1 mol/L醋酸钠溶液）∶V（乙腈）=85∶15，稀醋酸调节pH=6.85；检测波长：360 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：40℃;进样量：20μL。

　　2.2反应机制

　　DNFB（2，4-二硝基氟苯）在弱碱性条件下（pH为7.0~8.0）与氨基酸的α-氨基发生亲核取代反应，生成稳定的2，4-二硝基苯基（DNP）衍生物，反应式：氨基酸-NH2+DNFB→氨基酸-DNP+HF。

　　2.3测定

　　1）依次精密量取溶剂空白、对照品溶液、供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。

　　2）溶剂空白进样1针，第一份对照品溶液连续进样5针，第二份对照品溶液连续进样2针，供试品溶液各进样2针。

　　3）系统适用性试验要求：以氨基酸峰计，理论板数应大于5 000；第一份对照品溶液连续进样5针所得主峰面积的RSD不大于2.0%；两份对照品溶液连续进样7针所得校正因子f值的RSD不大于2.0%。

　　3方法可行性验证和可接受标准

　　3.1验证项目与可接受标准

　　验证项目和可接受标准见表1。

　　3.2系统适用性试验与专属性实验
       3.2.1确认方法

　　1）甘氨酸、丙氨酸对照溶液：精密称取甘氨酸20 mg、丙氨酸20 mg，分别置于500 mL容量瓶中，加注射用水溶解定容，得到0.04 mg/mL的甘氨酸对照溶液与0.04 mg/mL的丙氨酸对照溶液。取甘氨酸对照溶液与丙氨酸对照溶液各2 mL，分别加到10 mL玻璃试管中，各加入0.5 mol/L碳酸氢钠溶液2 mL和2，4-二硝基氟苯乙腈溶液0.8 mL，混匀，将试管进行密封，60℃恒温水浴振摇90 min。取出放冷，转移到10 mL容量瓶中，用PBS溶液润洗试管2~3次转移到容量瓶中并进行定容，摇匀后用0.45μm有机滤膜过滤约2 mL溶液到进样瓶中，即得甘氨酸对照品溶液与丙氨酸对照品溶液。

　　2）依次精密量取溶剂空白（1针）、甘氨酸对照品溶液（1针）、丙氨酸对照品溶液（1针）、对照品溶液（第一份连续进样5针，第二份连续进样2针）、供试品溶液（1针），注入液相色谱仪，记录色谱图。

　　3.2.2系统适用性与专属性结果

　　系统适用性专属性结果见表2、表3。

　　上述实验结果表明通过DNFB与氨基酸的α-氨基反应生成稳定的2，4-二硝基苯基（DNP）衍生物，显著提高了甘氨酸和丙氨酸在紫外检测器下的响应（检测波长360 nm）。其中甘氨酸：峰面积RSD仅0.06%，校正因子RSD=0.25%；丙氨酸：峰面积RSD=0.07%，校正因子RSD=0.24%。同时，溶剂空白在目标峰保留时间处无干扰峰，且供试品溶液中目标峰与相邻峰的分离度符合要求（甘氨酸分离度≥1.5，丙氨酸分离度≥3.2），表明方法能有效排除基质干扰。

　　甘氨酸和丙氨酸的理论板数均超过20 000（标准要求>5 000），表明色谱柱分离效率极高，能实现基线分离。此外，连续5针进样的甘氨酸峰面积RSD为0.06%，丙氨酸为0.07%（标准要求≤2.0%）。7针进样的校正因子RSD均<0.25%，远低于2.0%的可接受标准，证明仪器稳定性和方法重现性极佳。并且甘氨酸和丙氨酸的回收率（90%~108%）和精密度（RSD≤0.52%）达到国际通行的分析方法验证标准。并且所有验证参数（理论板数、重复性、专属性等）均符合《中国药典》2020年版和ICH Q2指南要求。

　　3.3线性实验
       3.3.1确认方法

　　1）本次验证中线性所涵盖的质量浓度范围为对照品溶液质量浓度的50%～150%（即0.02～0.06 mg/mL），在此范围内制备5个质量浓度的供试品，每个质量浓度各一份，每份供试品溶液各检测一次。

　　2）1份溶剂空白、2份对照品储备液（1 mg/mL）、2份对照品溶液（甘氨酸、丙氨酸质量浓度各为0.04 mg/mL）。

　　3）系列对照品溶液：精密量取对照品储备液（1 mg/mL），用注射用水稀释制成每1 mL中含甘氨酸与丙氨酸分别为0.02、0.03、0.05、0.06 mg的溶液。每个质量浓度制备1份。

　　4）依次精密量取空白（1针）、对照品溶液（第一份连续进样5针，第二份连续进样2针）、系列对照品溶液（各1针），注入液相色谱仪，记录色谱图。

　　3.3.2线性实验结果汇总

　　线性实验结果见表4、表5。

　　实验结果表明在0.02~0.06 mg/mL质量浓度范围内，甘氨酸和丙氨酸均表现出良好的线性关系，相关系数均>0.998，远高于0.99的可接受标准，证明线性范围优异。同时最低检测质量浓度0.02 mg/mL（相当于标示质量浓度的50%）仍能获得稳定响应，甘氨酸和丙氨酸的峰面积分别为948 294和1 114 019，信噪比满足定量要求，证明灵敏度高。并且各浓度点测定值偏差小，甘氨酸RSD为0.06%~0.25%，丙氨酸为0.07%~0.24%，表明衍生化反应完全且重现性优异。

　　3.4准确度(回收率)实验
       3.4.1确认方法

　　1）本次验证中准确度试验3个质量浓度分别为0.036 mg/mL（90%组）、0.044 mg/mL（110%组）、0.052 mg/mL（130%组），每个质量浓度各制备3份，每份溶液各检测一次。

　　2）1份溶剂空白、2份对照品贮备液（1 mg/mL）、2份对照品溶液（0.04 mg/mL）、2份供试品溶液。

　　3）准确度供试品溶液：取供试品1瓶，加入标示装量的注射用水，振荡溶解后全量转移到20 mL容量瓶中，共配制9份。分别取每瓶中的样品2 mL加到10 mL容量瓶中，每3份一组，每组分别精密加入1.0 mg/mL对照品溶液0.28 mL（90%组）、0.36 mL（110%组）、0.44 mL（130%组），加入注射用水定容，搅拌均匀。取上述溶液2 mL于10 mL试管中，分别加入0.5 mol/L碳酸氢钠溶液2 mL和2，4-二硝基氟苯乙腈溶液0.8 mL，混匀，60℃恒温水浴振摇90 min，取出放冷，转移到10 mL容量瓶中，PBS溶液润洗并定容，经0.45μm滤膜过滤至进样瓶中，即得到准确度供试品溶液。

　　4）依次精密量取溶剂空白（1针）、对照品溶液（第一份连续进样5针，第二份连续进样2针）、供试品溶液（各两针）、准确度供试品溶液（各1针）。

　　3.4.2加样回收率(R)计算公式[式(5)]

　　R=［（m2-m1）/m3］×100%.（5）
       式中：m1为样品氨基酸质量，mg；m2为加标后测定的氨基酸质量，mg；m3为加入的氨基酸对照的理论质量，mg。

　　3.4.3准确度(回收率)实验结果

　　准确度实验结果见表6、表7。

　　上述实验结果表明所有回收率结果均在90%~108%的可接受标准范围内，且回收率偏差小，准确性高。一方面，由于衍生化反应完全，DNFB与氨基酸的α-氨基反应稳定，确保检测信号与真实含量高度一致。另一方面，透明质酸钠复合溶液的复杂基质（如多糖、蛋白质）未显著影响衍生化效率或色谱分离，具有较强的干扰性，满足《中国药典》和ICH Q2对分析方法准确度的要求（回收率90%~108%）。

　　4结论

　　本研究成功建立了高效液相色谱（HPLC）结合2，4-二硝基氟苯（DNFB）衍生化的方法，用于透明质酸钠复合溶液中甘氨酸和丙氨酸含量的定量分析。该方法通过DNFB与氨基酸的α-氨基发生衍生化反应，显著提高了检测灵敏度（检测限达0.02 mg/mL），同时采用优化的色谱条件（C18柱，0.1 mol/L醋酸钠-乙腈流动相，pH 6.85）实现了甘氨酸和丙氨酸的基线分离（分离度≥1.5）。系统验证结果表明，该方法具有优异的线性（r>0.998）、精密度（RSD≤0.25%）和准确度（回收率95.3%~99.3%），完全满足《中国药典》和ICH Q2的规范要求。与传统方法相比，本方法避免了强酸水解或昂贵酶解步骤，具有操作简便、成本低廉、抗干扰能力强等优势，为透明质酸钠复合溶液的质量控制提供了可靠的分析手段。该技术的成功开发不仅为生物材料中氨基酸的定量分析提供了新思路，也为相关产品的工艺优化和标准制定奠定了方法学基础。

参考文献

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　　[3]孟晓依，李春月，王欣，等.注射用透明质酸钠复合溶液中氨基酸含量的测定[J].中国医疗器械信息，2025，31（3）：37-40.

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