摘要：目前大肠埃希氏菌被用作评估水质的标准之一，它可以显示水样是否受到了粪便的污染。利用微生物测定滤膜法进行水质检测是一种非常重要的手段。该方法采用滤膜法测定生活饮用水中的大肠埃希氏菌，分析了不同浓度水样的精密度，在微生物含量较低水样中精密度可达5.6%；采用此方法测定有证标准物质，测定结果均在参考值范围内；通过空白对照实验说明检测过程未受到污染，通过阳性菌及阴性菌实验说明本实验室使用的培养基合格且检测结果可靠、有效，能满足国标的相关要求，可以用于生活饮用水中大肠埃希氏菌的测定。

　　关键词：滤膜法；大肠埃希氏菌；精密度

　　0引言

　　生活饮用水的质量与人类健康息息相关，微生物污染是影响饮用水安全的关键因素之一[1]。水中存在的病原微生物可能引发腹泻、呕吐、伤寒等各类疾病，严重威胁人体健康。因此，对生活饮用水进行微生物检测至关重要，它是保障饮用水安全、预防水源性疾病传播的必要手段。大肠埃希氏菌（Escherichia coli）作为粪便污染的指示菌，在水质监测中具有举足轻重的地位[1-2]。人体肠道内存在大量的大肠埃希氏菌，若饮用水受到粪便污染，该菌就极易在水中被检出。所以，准确测定生活饮用水中大肠埃希氏菌的含量，对于评估水质卫生状况、保障公众健康具有关键意义[3]。滤膜法作为检测水中大肠埃希氏菌的常用方法之一，具有诸多优势。与传统的多管发酵法相比，它操作相对简便，能够快速过滤大量水样，通过浓缩效应提高微生物检测的灵敏度，使检测结果更为可靠。然而，尽管滤膜法在实际应用中广泛使用，但其检测结果的精密度研究尚显不足。深入探究滤膜法测定生活饮用水中大肠埃希氏菌的精密度，对于优化检测流程、提高检测准确性、确保水质监测数据的可靠性具有重要的现实意义，能够为饮用水微生物检测提供更坚实的技术支撑，保障公众饮用水安全。

　　1研究现状与方法

　　1.1国内外研究现状

　　在国外，滤膜法早已广泛应用于饮用水微生物检测领域[4]。许多发达国家制定了严格的标准操作规程，对滤膜的材质、孔径、过滤水样体积、培养条件等关键因素进行规范，以确保检测结果的准确性与可比性。一些研究聚焦于优化滤膜法的操作流程，通过改进过滤装置，提高过滤效率，减少微生物在过滤过程中的损失。还有研究致力于开发新型的选择性培养基，增强对大肠埃希氏菌的特异性识别，降低假阳性结果的出现概率。在精密度研究方面，国外学者运用先进的统计方法，结合大量的实验数据，分析不同实验室间以及实验室内滤膜法检测结果的变异系数，评估该方法在不同环境条件下的稳定性。

　　国内对于滤膜法的应用也相当普遍，相关研究主要集中在与传统检测方法（如多管发酵法）的对比分析上[5]。研究表明，滤膜法在检测速度和操作便捷性上具有优势，尤其适用于大规模水样筛查。然而，在精密度研究方面，国内的工作尚存在一些不足。部分研究仅针对少数水样进行简单的重复性测试，缺乏系统性的实验设计与深度数据分析；对于影响滤膜法精密度的因素探讨不够全面，未能充分考虑到水样来源、水质成分、操作人员技能水平以及仪器设备差异等多方面因素的综合影响。此外，不同地区实验室间的协作研究较少，缺乏统一的多中心验证数据，难以形成具有广泛代表性的精密度评价结论，限制了滤膜法在国内水质监测领域的进一步优化与推广应用[6]。

　　1.2检测原理

　　用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤水样后，将滤膜贴在选择性培养基上培养后，能形成典型菌落经革兰氏染色和证实试验，来检测水中总大肠菌群的方法。将总大肠菌群滤膜法检测阳性的滤膜，置于含有荧光底物的培养基上培养，能产生β-葡萄糖醛酸酶，分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光，以此来检测水中大肠埃希氏菌的方法[7]。

　　1.3材料与试剂

　　1.3.1试剂

　　品红亚硫酸钠琼脂、乳糖蛋白胨培养液、MUG营养琼脂培养基，北京陆桥技术股份有限公司。

　　1.3.2仪器设备

　　高压蒸汽灭菌器，型号：TOMY SX500；恒温培养箱，型号：LHS-100SC；手提式暗箱紫外分析仪，型号：ZK-5；正置显微镜，型号：Primo Star；0.45μm无菌滤膜，塞多利斯公司。

　　1.3.3标准菌株

　　阳性标准菌株：大肠埃希菌CICC 24176，中国工业菌种保藏中心；阴性标准菌株：铜绿假单胞菌菌种号CICC 21636，中国工业菌种保藏中心。

　　1.4实验方法

　　1.4.1接种

　　在无菌操作条件下将有典型菌落生长的总大肠菌群阳性滤膜转移到MUG营养琼脂培养基平板上，细菌截留面朝上，进行培养。

　　1.4.2培养

　　将已接种的MUG营养琼脂培养基平板于36℃±1℃下培养4 h。

　　1.4.3处理

　　将培养后的MUG营养琼脂培养基平板在暗处用波长为366 nm、功率为6 W的紫外灯照射，如果菌落边缘或菌落背面有蓝色荧光产生则表示该菌落为大肠埃希氏菌。

　　2结果与分析

　　2.1低浓度水样检测结果

　　根据表1数据可知，通过预实验选择的低浓度水样进行了6次平行检测，大肠埃希氏菌平行检测结果平均值为46 CFU/100 mL，标准差为2.6 CFU/100 mL，精密度为5.6%。

　　2.2中浓度水样检测结果

　　根据表2数据可知，通过预实验选择的中浓度水样进行了6次平行检测，样品稀释10倍，大肠埃希氏菌平行检测结果平均值为4.0×102 CFU/100 mL，标准差为31 CFU/100 mL，精密度为7.6%。

　　2.3高浓度水样检测结果

　　根据表3数据可知，通过预实验选择的高浓度水样进行了6次平行检测，样品稀释1.0×103倍，大肠埃希氏菌平行检测结果平均值为2.3×104 CFU/100mL，标准差为1.4×103 CFU/100mL，精密度为6.1%。

　　2.4准确度检测结果

　　购买中国工业微生物菌种保藏管理中心FTQC-75-07大肠埃希氏菌标准物质，产品编号：B0622，生产批号：20232102-1，参考值52 CFU/100 mL，参考值范围29~94 CFU/100 mL。根据表4数据可知，测定结果平均值为55 CFU/100 mL，测定结果均在参考值范围内。

　　2.5阳性标准菌株菌悬液检测结果

　　用大肠埃希菌（Escherichia coli，CICC 24176）作为阳性菌，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，CICC 21636）作为阴性菌，制成菌悬液，将菌悬液按接种和培养要求操作，阳性菌株应呈现阳性反应。

　　2.6阴性及空白对照

　　阴性对照实验参照阳性对照实验检测方法，经24 h培养后，阴性对照的平板上颜色未发生变化，呈现阴性反应，该次样品测定结果有效。测定大肠埃希氏菌空白时，用无菌水代替试样参照阳性对照实验检测方法经24 h培养后的平板均无任何颜色反应，检测结果满足实验要求。

　　3提高滤膜法精密度的策略与建议

　　3.1培养基与试剂管理

　　培养基与试剂的质量直接关乎实验成败，制定严格的采购验收标准是首要任务。对于MUG营养琼脂培养基，要求供应商提供详细的成分分析报告，确保关键营养成分（如蛋白胨、酵母提取物、氯化钠等）含量精确，误差控制在±5%以内；检查培养基外观，应质地均匀、无结块、无杂质，色泽符合标准要求。试剂方面，如用于稀释水样的生理盐水，需检测其微生物限度，细菌、真菌含量应低于10 CFU/mL；缓冲液的pH值需精确在规定范围±0.1内，电导率符合理论值±5%偏差范围。在保存与使用过程中，建立有效的监控机制。培养基应避光、密封存放在4℃冰箱，定期（每季度）抽样检测其营养成分有效性，可通过接种标准大肠埃希氏菌菌株，观察生长速率与荧光产生情况，若生长缓慢或荧光微弱，及时排查是否培养基变质；试剂取用遵循“先进先出”原则，每次取用后详细记录使用量、使用时间、取用人员等信息，对易挥发、易氧化试剂（如酶底物），使用后立即密封并充入惰性气体保护，定期（每月）核查试剂有效期，临近有效期3个月的试剂需优先使用或及时更换，确保实验全程试剂质量可靠，为精准检测提供保障。

　　3.2标准化操作流程建立

　　为确保滤膜法测定生活饮用水中大肠埃希氏菌实验的准确性与重复性，编制涵盖实验全流程的详细操作手册至关重要。手册内容应从样品采集开始，明确规定采水前水龙头的处理方式，如对于自来水采样，需精确说明打开水龙头放水的时长（出厂水采样前放5 min，管网末梢水放3 min等），以及龙头灭菌消毒的具体方法（火焰灼烧3 min或70%酒精擦拭等），确保水样采集的规范性，避免外界污染引入。结果观察与记录部分，提供标准的菌落形态图谱、荧光特征描述及示例照片，规范菌落计数方法，要求详细记录水样编号、采样到观察各环节时间、操作人员等信息，便于追溯与数据分析。手册以图文并茂、步骤细化的形式呈现，确保不同操作人员能依据手册精准执行实验流程，减少人为操作差异带来的误差，提升实验精密度。

　　3.3实验室环境维护

　　良好的实验室环境是保障滤膜法精密度的关键因素之一。建立严格的日常清洁制度至关重要，实验台面在每次实验前后均需用70%~75%酒精棉球擦拭，去除可能残留的微生物与杂质；地面每日至少清扫一次，并定期用含氯消毒剂拖地消毒，有效杀灭地面微生物；实验器具使用完毕后应立即清洗，先用洗洁精去除污垢，再用蒸馏水冲洗干净，晾干后放入专用收纳柜，防止交叉污染。消毒措施不可或缺，每周至少进行一次全面紫外线消毒，在无人员操作时，开启紫外线灯照射实验室空间不少于30 min，对空气、台面、仪器表面等进行杀菌；对于关键仪器设备，如培养箱、净化工作台等内部，每月使用专用消毒剂擦拭消毒一次，确保仪器内部洁净无菌。温湿度调控直接影响实验结果，配备高精度温湿度计实时监测环境温湿度，将温度控制在20~25℃,相对湿度维持在40%~60%。当温度偏离设定范围时，通过空调系统精准调节；湿度异常时，利用除湿机或加湿器进行干预，为实验创造稳定适宜的环境条件，持续符合实验要求，降低环境因素对滤膜法精密度的不利影响。

　　4结论

　　本研究围绕滤膜法测定生活饮用水中大肠埃希氏菌的精密度展开了系统、深入的探究。通过对国内外研究、实验原理和流程的详细阐述，明确了滤膜法基于微孔滤膜过滤和酶促反应产荧光检测的科学性与可靠性。

　　从影响因素来看，实验材料方面，滤膜的孔径、材质及品牌对细菌截留与检测结果影响显著，培养基成分、纯度、pH值以及试剂的纯度、稳定性与保存条件均在不同程度上影响实验结果；操作流程中，过滤环节的抽滤压力、时间，培养条件的温度、时间把控以及菌落计数的人为、仪器因素是决定精密度的关键节点；环境因素里，实验室洁净度与温湿度对微生物污染风险及细菌生长代谢起着关键作用，任何波动都可能干扰检测结果准确性。

　　实证研究中，通过对低、中和高浓度的水样中的大肠埃希氏菌进行检测，详细分析了滤膜法在实际应用中的精密度表现。低浓度、中浓度和高浓度水样精密度检测结果分别为5.6%、7.6%和6.1%，表明中间精密度受人员、仪器影响虽在可接受范围，但仍需优化，但高菌量水样及复杂供水场景下有待提升；采用此方法测定有证标准物质，参考值为52 CFU/100 mL，测定结果均值为55 CFU/100 mL，测定结果均在参考值范围内；通过空白对照实验说明检测过程未受到污染，通过阳性菌及阴性菌实验说明本实验室使用的培养基合格且检测结果可靠、有效。基于上述研究，提出从实验材料优化筛选、建立标准化操作流程、强化环境监控与应急管理等多维度提升精密度的策略建议，为滤膜法在饮用水微生物检测领域的精准应用提供了全方位技术支撑。

参考文献

　　[1]国家市场监督管理总局，国家标准管理委员会.生活饮用水标准检验方法第12部分：微生物指标：GB/T5750.12—2023[S].北京：中国标准出版社，2023.

　　[2]徐新龙，杨杰，李玉龙，等.浅析生活饮用水中水质微生物检测能力验证的结果与质量控制[J].食品安全导刊，2023（22）：103-106.

　　[3]雷静，廖爽，乔茜茜，等.固定酶底物法测定生活饮用水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌精密度分析[J].科技资讯，2022，20（14）：124-126.

　　[4]李曼莉，傅博强，唐治玉，等.生活饮用水中大肠埃希氏菌检测能力验证样品研制与应用[J].计量科学与技术，2022，66（6）：60-64.

　　[5]Andrée F.Maheux,Dion-Dupont V,Bisson MA,et al.Detection of es-cherichia coli colonies on confluent plates of chromogenic media used in membrane filtration[J].Journal of microbiological methods,2014(97):51-55.

　　[6]周秀丽.分析生活饮用水微生物检验方法及其评价标准[J].世界最新医学信息文摘，2017，17（96）：141.

　　[7]邵云金.生活饮用水微生物检验方法和评价标准分析[J].继续医学教育，2016，30（5）：128-129.