摘要：文章从黄粉虫肠道中筛选出了具有降解聚乳酸能力的微生物，鉴定其菌种并测定降解菌的降解特性。将PLA粉末作为唯一食物喂养黄粉虫60 d，然后将其肠道提取液接种到以PLA为唯一碳源的固体培养基上进行富集、筛选和纯化降解菌。通过菌种形态观察和DNA测序等手段进行菌种鉴定，检测其在不同营养添加条件下的PLA降解效能。通过筛选获得一株PLA降解菌（Fusarium genus LT-1），初步鉴定为镰刀菌，随后将其接种到不同培养基中，连续振荡培养40 d，得到其对PLA的降解率为10.55%。结果显示，利用PLA材料喂食黄粉虫，可有效改变其肠道微生物菌群；同时将以PLA为唯一碳源的无机盐培养基作为筛选平板，能快速、高效地筛选出PLA降解菌。文章为PLA塑料的生物降解提供了参考。

　　关键词：黄粉虫；聚乳酸；肠道微生物；生物降解

　　聚乳酸，又称聚丙交酯（Polylactic acid，PLA），展现出优良的生物可降解性、生物相容性和力学性能，具有广阔的发展前景[1-2]。然而，PLA的降解需要在特定条件下进行，在自然环境中难以实现。这意味着当前的PLA废弃物难以实现有效处理，会引起潜在的环境问题。因此，如何有效处理PLA生物降解塑料的废弃物，成为科研人员关注和研究的重点。

　　昆虫肠道具备降解难以被昆虫消化的食物的能力，能为宿主提供一定的营养。同时，昆虫的肠道结构和摄取食物结构会对微生物群落产生影响。鉴于昆虫肠道与其肠道微生物菌群之间的关系，可通过一些技术和方法来富集环境样品混合菌群中的某一类菌，使其变成优势菌，从而提高该类菌的筛选效率。以黄粉虫为代表的一类昆虫对恶劣环境具有极强的适应能力。陈冠舟等[3]利用高通量测序法探究了啮食泡沫塑料黄粉虫的肠道菌群结构，揭示了黄粉虫肠道细菌具有多样性，并提出肠道细菌在黄粉虫降解塑料的过程中可能发挥着主导作用。冯娟等[4]综述了黄粉虫对塑料有较强的取食能力，并从其体内成功分离出了数株微生物。王子君[5]发现，黄粉虫能啮食聚苯乙烯泡沫并表现出明显的生长现象。

　　同时，其采用NA与LB 2种培养基对黄粉虫肠道菌进行了好氧培养，在以聚苯乙烯为唯一食物来源的分组中分离出了8株菌。

　　利用微生物处理PLA生物塑料废弃物是当前研究的热点。一些实验室虽具备筛选生物降解塑料微生物的能力，但对于降解工艺、降解菌剂的开发以及现实应用等仍缺少研究。因此，本文旨在为PLA塑料降解菌提供更多的菌质资源。

　　1材料与方法

　　1.1材料、试剂及仪器

　　1.1.1黄粉虫

　　100目PLA（Polylactic Acid）、PBS（Polybutylene Succinate）、PCL（Polycaprolactone）粉末，购自东莞市精科高分子材料有限公司；黄粉虫，虫体2 cm左右，购自椒江花鸟市场。

　　实验主要试剂为化学纯，国药集团药业股份有限公司。

　　1.1.2实验仪器设备

　　GWB-1E超纯水器，北京普析通用仪器有限公司；SX-500全自动高压灭菌锅，日本Tomy DigitalBiology公司。

　　1.2实验方法

　　1.2.1黄粉虫的喂养

　　对黄粉虫饥饿处理3 d后，选取200条形态大小均匀的置于25±2℃环境下饲养，并将其平均分为两组，每组各100条。一组喂养麦麸（对照组），另一组只喂养PLA粉末，其他条件保持一致。

　　1.2.2黄粉虫肠道微生物分离、纯化和筛选

　　取经PLA喂食60 d、大小一致的黄粉虫10条，在流水下冲洗5 min，于超净工作台上制作成肠道微生物提取液。进行梯度稀释，各取100μL涂布于PLA培养基上。后放入37℃的培养箱中进行培养，观察并记录。

　　1.3降解菌的鉴定

　　1.3.1降解菌的形态结构

　　观察菌株在PLA无机盐培养基平板上的生长状况，包括形状、形态、颜色、产孢、菌丝等形态学观察。

       1.3.2降解菌的生理生化鉴定

　　将降解菌在不同培养基上进行培养，并开展生理生化鉴定。

　　1.3.3降解菌的分子鉴定及基因树

　　以筛选出的微生物总基因作为模板，采用真菌提取试剂盒提取DNA，用鉴定通用引物扩增分离菌ITS序列，并送至上海生物工程有限公司进行测序。将测序结果序列通过NCBI（National Center for Biotechnology Information，美国国家生物技术信息中心）进行BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）比对。

　　1.4降解菌的降解性能鉴定

　　1.4.1失重法测量降解菌对PLA的降解率

　　将PLA薄膜裁剪为5 cm×5 cm的尺寸，经蒸馏水洗涤并浸泡15 min，60℃烘干4 h，以2张为一份，准确称取M0及记录数据。添加到装有已灭菌的100 mL无机盐液体培养基的500 mL锥形瓶中，接种活化得到菌液。将菌液固定于摇床上，180 r/min、30℃条件下培养30 d，并将不接种的PLA薄膜无机盐设置为对照。每5 d取样一次，待降解实验结束后，倾出培养液，将残留PLA膜进行过滤收集、超声波清洗、60℃烘干4 h后准确称重M1。

　　PLA膜失重率（%）=（M0-M1）/M0×100%（1）

　　2结果与分析

　　2.1筛选土壤筛选

　　埋有黄粉虫粪便处的土壤稀释液不同浓度PLA培养情况如图1所示。

　　2.2微生物培养

　　2.2.1降解菌在不同培养温度、不同培养基中的生长情况

　　降解菌在不同培养温度和不同培养基中的生长情况具体如图2所示。

　　LT-1在25℃PLA固体培养基中生长状况良好，气生菌丝呈白色，无孢子产生，产生粉色的色素；在30℃PLA固体培养基中生长状况一般，气生菌丝呈白色，无孢子产生，产生粉色的色素；在35℃PLA固体培养基中不生长，无气生菌丝，无孢子产生，无色素产生。由此可知，降解菌LT-1的最适生长温度是25℃。

　　LT-1在25℃的淀粉培养基、干酪素培养基、高氏1号培养基、完全培养基、PDA固体培养基中均生长旺盛，呈圆形，同时气生菌丝呈白色，无孢子产生。在淀粉培养基、完全培养基、PDA固体培养基上产粉色色素；在干酪素培养基上不产色素；在高氏1号培养基上产黄色色素。

　　2.2.2菌种鉴定

　　将菌株LT-1的ITS序列在NCBI上进行BLAST比对。在下载相似度较高的参考序列后，使用MEGA7软件内置的ClustalW程序进行序列的多重比对并结合菌落形态确定本降解菌为Fusarium　genus。

　　2.2.3降解聚乳酸结果

　　培养30 d后，Fusarium genus LT-1对PLA350目的降解率可达10.55%。

　　3总结与讨论

　　本文利用PLA材料改变黄粉虫肠道微生物菌群，同时将以PLA为唯一碳源的无机盐培养基作为筛选平板，快速有效地筛选出了PLA降解菌；并将降解菌接种到不同营养物质、不同质量浓度的液体培养基中进行培养，发现PLA的降解率可达10.55%。本文首次报道了Fusarium genus具有降解PLA生物塑料的潜力，为Fusarium genus的应用和功能开发提供了新的视角，也为PLA塑料降解菌的资源增添了种类。

　　现有实验室虽具备筛选生物降解塑料微生物的能力，但缺少对微生物降解PLA的降解工艺、关键酶研发和现实应用等的研究。为此，如何获得高效的PLA塑料降解菌，并研究其关键降解酶及酶活特征等[6]，是研究PLA塑料降解的重要方向。

　　参考文献

　　［1］邓春兰,应必仕,银锦国,等.聚乳酸改性和降解的研究进展［J］.塑料科技,2022,50(3):100-103.

　　［2］姚逸,王超军,欧阳春平,等.生物降解塑料聚乳酸研究进展［J］.广东化工,2021,48(17):75-76.

　　［3］陈冠舟,张白鹭,纪梦梦,等.高通量测序探究啮食聚苯乙烯泡沫塑料黄粉虫的肠道菌群结构［J］.微生物学通报,2017,44(9):2011-2018.

　　［4］冯娟,朱廷恒,罗春萍,等.黄粉虫(Tenebrio molitor)肠道中聚乳酸塑料降解菌的筛选及其降解特性［J］.浙江农业学报,2022,34(6):1277-1286.

　　［5］王子君.黄粉虫幼虫啮食聚苯乙烯泡沫塑料的肠道组学研究［D］.呼和浩特:内蒙古师范大学,2021.

　　［6］谢彬,白茸茸,孙华山,等.聚乳酸塑料合成、生物降解及其废弃物处置的研究进展［J］.生物工程学报,2023,39(5):1912-1929.