摘要：文章为探究人血白蛋白对破伤风液体毒素稳定性的影响，取同一批次冻干破伤风毒素，分别配制成加入人血白蛋白和不加入人血白蛋白的2种破伤风液体毒素，并对其试验量测定结果进行对比分析。结果显示，不含人血白蛋白的破伤风液体毒素在6个月内毒素试验量下降了约34.5%；加入人血白蛋白的破伤风液体毒素试验量没有下降。由此表明，人血白蛋白可提高破伤风液体毒素的稳定性。

　　关键词：破伤风毒素；人血白蛋白；效价；试验量

　　破伤风毒素（Tetanus toxin，TeNT）是由破伤风杆菌产生的一种神经蛋白毒素，这种蛋白质会使感染者的抑制性突触无法释放神经递质，从而引起反射亢进和横纹肌痉挛，最终导致机体死亡。破伤风毒素毒性较强，估计人体致死剂量低于2.5 ng/kg，未经治疗病死率高达40%[1]。而破伤风人免疫球蛋白（Human tetanus immunoglobulin，HTIG）含有高效价的破伤风抗毒素，能够中和破伤风毒素，预防和治疗破伤风杆菌感染。自1960年诞生以来，人破伤风免疫球蛋白就表现出了较好的破伤风预防效果和安全性[2]，因此目前我国预防及治疗破伤风大量依赖破伤风抗毒素的使用。公开数据显示，仅以2017年计，人破伤风免疫球蛋白市场容量就达到了350万支，存在巨大的国内外临床需求[3]。

　　在《中国药典》2020年版四部3508破伤风抗毒素效价测定法（小鼠试验法）中，破伤风毒素是最重要的试剂之一。破伤风毒素由1 315个氨基酸组成，其分子量约为150 kD[4]。根据结构与功能差异，将破伤风毒素划分成3个结构区域：轻链（Light chain，Lc）、重链N端（N-terminal of Heavy chain，Hn）、重链C端（C-terminal of Heavy chain，Hc），每个结构域大小均在50 kD左右[5-6]。重链C端结构域负责与神经细胞结合后内吞形成囊泡；重链N端结构域主要帮助轻链穿过囊泡膜进入神经细胞；而轻链分子是一种锌依赖蛋白酶，通过链间二硫键与重链连接，到达细胞质后二硫键被还原并被释放到神经元的细胞质中，从而发挥毒性作用[1]。重链是毒素与神经细胞表面神经节苷酯的结合部位，轻链具有毒性，但必须与重链联合才能致病[7]。重链C端结构域内含有4个半胱氨酸，极易形成分子间及分子内二硫键，从而出现不同形式的单体及多聚体。这种不同构象形式可随蛋白浓度、环境温度及缓冲液条件的变化而相互转换[8]，可能会使液体毒素在2~8℃的环境中避光保存时，出现毒素毒力不稳定的情况。

　　在破伤风抗毒素效价测定中，对照组小鼠应在72~120 h全部死亡，但破伤风液体毒素毒力的不稳定性降低了对照小鼠组在72~120 h全部死亡的可能性，提高了试验重试率，不符合动物福利要求。稳定剂是指能够增强溶液、胶体、固体、混合物的稳定性的物质，能够减慢反应，保持化学平衡，降低表面张力，防止光、热分解或氧化分解。生物制品稳定剂主要是指能用于稳定或保护生物制品的有效成分，可防止其降解或失去活性[9]。在流感疫苗[10]、狂犬病疫苗的生产过程中，人血白蛋白（Human serum albumin，HSA）常作为稳定剂加入其中，通常情况下，其作为稳定剂浓度在1%~5%。本试验通过对不含人血白蛋白液体毒素和含人血白蛋白液体毒素的试验量测定结果进行对比分析，研究人血白蛋白对破伤风液体毒素稳定性的影响。

　　1材料

　　1.1仪器设备

　　表1为本试验所用的仪器设备清单。

　　1.2试剂

　　表2为本试验所用的试剂清单。

　　2试验方法

　　2.1破伤风液体毒素制备

　　不含人血白蛋白破伤风液体毒素（对照组）的制备：取1瓶冻干液体毒素，用5 mL 0.9%氯化钠注射液溶解，加入5 mL中性甘油（经116℃、10 min灭菌处理）混合均匀，于2~8℃避光处保存备用。

　　含人血白蛋白破伤风液体毒素（试验组）的制备：取1瓶冻干液体毒素，用5 mL 0.9%氯化钠注射液溶解，加入5 mL中性甘油（经116℃、10 min灭菌处理）混合均匀，另加入3.3 mL人血白蛋白混合均匀，于2~8℃避光处保存备用。

　　2.2破伤风抗毒素标准品的稀释

　　先用硼酸盐缓冲液预稀释至1.62 IU/mL，于2~8℃环境中保存备用，临用时再用硼酸盐缓冲液稀释至0.5 IU/mL。

　　2.3操作方法

　　将对照组和试验组分别稀释至每1 mL约含5个试验量，与等量0.5 IU/mL的破伤风抗毒素标准品溶液混合均匀，加塞，37℃结合1 h，以0.4 mL/只的剂量于体重17~19 g的NIH小鼠进行大腿根部皮下注射，每个稀释度各注射3只，连续观察5 d，选取72~120 h小鼠全部死亡的稀释倍数作为破伤风液体毒素的最适稀释倍数。将最适稀释倍数乘以5，即为破伤风液体毒素的试验量（1/10 L+）。按照上述操作方法，分别于0、1、2、3、4、8、16、20、24、28周对两组破伤风液体毒素进行试验量测定。

　　由图1可知，在2~8℃避光保存条件下，对照组的毒力出现了一定程度的下降，6个月内毒素毒力下降了约34.5%；而试验组毒力则保持稳定水平，未发现下降。

　　4讨论

　　本次试验结果显示，加入人血白蛋白后，破伤风液体毒素的稳定性得到了显著提高。

　　破伤风毒素是一种完全蛋白，等电点pH为5.0~5.2。当溶液的pH下降至6.0时，毒素开始沉淀并失去活性；但在含有赖氨酸时，pH降至5.0也能保持稳定[11]。人血白蛋白是一种含有585个氨基酸的小分子球状蛋白质[12]，由3个相似结构域（I~Ⅲ)组成，每个结构域包含2个亚级结构（A和B），分别由4个和6个α螺旋组成，结构域间的二硫键和亚级结构间通过脯氨酸残基提供的灵活环结构进行相对移动，以帮助白蛋白与各种物质结合[13]。生理情况下，人血白蛋白主要以带一个自由硫氢基的还原形式存在，也被称为硫基白蛋白[12]，其含有带大量电荷的赖氨酸，具有亲水性、无免疫原性、生物相容性、化学稳定性以及与多种药物存在结合位点等优势，主要用作生物制品的稳定剂和保护剂，以稳定或保护其有效成分，防止其降解或失去活性[14]。人血白蛋白的化学成分相对复杂，究竟是人血白蛋白中的哪种成分提高了破伤风液体毒素的稳定性尚有待研究。

　　［1］刘旭阳.破伤风毒素功能结构域生物学功能与免疫效力研究［D］.开封:河南大学,2023.

　　［2］陈羽婷,马慧敏,熊号峰,等.48例成人破伤风患者的临床特点及救治分析［J］.北京医学,2018,40(7):683-686.

　　［3］林淑健.全人源抗破伤风毒素单克隆抗体筛选与功能研究［D］.广州:暨南大学,2019.

　　［4］MADISON Z,MATTHEW B,T J B.Tetanus toxin cis-Loop contributes to Light-Chain translocation［J］.mSphere,2020,5(3):e00244-20.

　　［5］WANG Y M,WU C W,YU J F,et al.Structural basis of tetanus toxin neutralization by native human monoclonal antibodies［J］.Cell Reports,2021,35(5):109070.

　　［6］O'NEIL P T,VASQUEZ-MONTES V,SWINT-KRUSE L,et al.Spectroscopic evidence of tetanus toxin translocation domain bilayer-induced refolding and insertion［J］.Biophysical Journal,2021,120(21):4763-4776.

　　［7］陈所贤.破伤风研究进展［J］.中国热带医学,2003,3(1):57-58.

　　［8］OMAR Q,BARBARA B,DENNIS C,et al.The HC fragment of tetanus toxin forms stable,concentration-dependent dimers via an intermolecular disulphide bond［J］.Journal of Molecular Biology,2007,365(1):123-134.

　　［9］国家药典委员会.中华人民共和国药典三部2020年版［M］.北京:中国医药科技出版社,2020.

　　［10］周庆玲,于晶,谢英林,等.大流行流感疫苗稳定剂的筛选［J］.中国生物制品学杂志,2015,28(4):360-363.

　　［11］鲍行豪,罗海波.破伤风毒素及其致病机理的研究进展［J］.国外医学(微生物学分册),1983(3):106-110.

　　［12］段红杰,柴家科,邓虎平.人血白蛋白的功能及其在危重病治疗中的应用［J］.解放军医学杂志,2012,37(10):926-929.

　　［13］崔京南,李鹏波,冯磊.一种人血清白蛋白的检测试剂及定量检测方法［P］.江苏省:CN 201610156016.0,2018-12-18.

　　［14］马海燕,王世聪,郄正刚.重组人血白蛋白在药用辅料中的应用［J］.中国生物制品学杂志,2014,27(10):1359-1360.