摘要：传统微生物检测方法耗时较长、灵敏度较低，无法对微生物开展定量分析。在此背景下，PCR技术凭借其高灵敏度被广泛应用于食品微生物检测领域，有效提高了食品微生物安全检测的准确度。基于此，文章对PCR技术在食品微生物安全检测中的应用展开研究，以期为PCR技术的优化提供理论参考。

　　关键词：PCR技术；食品微生物检测；优化

　　微生物污染会引起食品变质和营养价值降低，进而导致食源性疾病爆发。因此，食品微生物检测至关重要。当前，传统食品微生物检测方法普遍存在问题。在此背景下，PCR（聚合酶链式反应）技术因其特异性强的优点被广泛应用于食品微生物检测，可实现定性检测，以及精确地定量分析。然而，PCR技术在实际应用中也存在一定不足，具体表现为引物和探针设计不合理，易造成假阳性或假阴性结果。分子生物学中的特异性结合理论认为：引物与模板DNA的特异性结合可促使PCR扩增成功。根据该定理，优化引物设计可有效提高PCR检测的特异性和灵敏度。

　　1 PCR技术

　　聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外扩增特定DNA片段的分子生物学技术。PCR反应的基本原理是基于DNA的半保留复制过程，通过特异性引物和热稳定DNA聚合酶等反应组分在一定热循环条件下进行多轮扩增，实现从极少量的DNA样本中获得大量特定DNA序列。在PCR反应步骤中，需将反应温度降至50~65。C，以使设计好的特异性引物与模板DNA的互补序列特异性相结合，从而形成引物-模板复合物，确保引物能高效且特异性地与目标序列结合，同时避免与非特异性序列的结合。DNA聚合酶在适宜温度下（通常为72。C），可通过添加4种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）将引物延伸，合成新的DNA链，从而使每个引物-模板复合物都能生成新的双链DNA，完成一个完整的扩增周期。

　　2 PCR技术在食品微生物安全检测中的优势

　　2.1高灵敏度和特异性

　　PCR技术的高灵敏度体现为其能检测到样品中极微量的目标DNA。由于致病菌在食品中的含量很低，传统检测方法往往难以检测到这些微量的致病菌，此时PCR技术的重要性就尤为突出。PCR技术可使原本微量的DNA实现大量复制，从而提高微生物检测的灵敏度。在检测沙门氏菌、大肠杆菌O157和李斯特菌等常见食源性致病菌时，PCR技术能够在数小时内提供准确的检测结果，而传统培养方法则可能需要花费数天的时间。特异性指PCR技术能准确识别并扩增特定的目标DNA序列，且不与其他非目标序列发生非特异性结合。特异性结合确保了PCR反应只扩增目标DNA片段，而不会扩增非目标序列，避免了非特异性扩增带来的假阳性结果。PCR技术通过设计特异性引物，能够准确检测出食品中的沙门氏菌、大肠杆菌O157等特定致病菌，并使检测结果更为准确可靠，减少假阳性和假阴性结果的出现[1]。

　　2.2快速检测

　　PCR技术通过体外扩增特定DNA片段，可在短时间内实现对目标微生物的检测和鉴定。典型的PCR反应仅需数小时便可完成，有利于对食品生产和质量控制环节的实时监测，从而可以快速、有效地应对潜在的食源性疾病暴发风险。这一快速检测能力提升了食品安全监控的效率，也显著降低了检测过程中的二次污染风险[2]。在实际应用过程中，PCR技术可直接从样品中提取DNA，无需经过复杂的富集和培养步骤，加快了检测速度，也减少了操作过程中的人为误差和污染风险。具体来说，PCR技术能实时监测生产加工过程中的各个环节，快速筛查原料，检测环境和产品的微生物状况，有效提高食品安全检测的效率和可靠性，为食品生产企业和监管机构提供快速制订应对措施的科学依据。

　　3 PCR技术在食品微生物安全检测中的应用

　　3.1实时荧光定量PCR（qPCR）

　　实时荧光定量PCR（qPCR）结合了传统PCR技术的高灵敏度和高特异性，同时引入了荧光染料或荧光探针，可实时监控并量化扩增过程中的DNA量。荧光染料如SYBR Green等可与双链DNA结合，并根据PCR扩增反应不断增加荧光强度；荧光探针如TaqMan探针等，则可通过目标序列的特异性水解释放荧光信号，使每个扩增周期中的DNA量都可被精确量化[3]。qPCR的实时监测机制不仅能提供高效扩增能力，还能在各个循环中精确记录扩增产物的数量，从而实现对目标DNA的动态量化。在食品微生物安全检测领域，qPCR技术可在检测食品样品中微生物存在的同时，对其含量进行定量分析，从而更准确地评估食品的安全性。例如，在检测食品加工环境中的微生物污染时，qPCR技术能够提供精确的微生物负荷数据，帮助食品生产企业评估并优化卫生控制措施，降低微生物污染风险。

　　3.2数字PCR（dPCR）

　　数字PCR（dPCR）通过将传统PCR反应分成成千上万个独立的小反应单元，实现了对目标DNA分子的绝对定量。其无需依赖标准曲线进行定量分析，而是通过统计学方法直接计数阳性反应单元中的目标分子数，可提供高度精确且绝对的DNA定量结果。在dPCR中，样品中的DNA会被分散到数万个微滴或纳升级反应孔中，且每个单独的反应单元中仅包含一个或少数几个DNA分子。经过PCR扩增后，利用荧光信号检测每个单元中的扩增结果，阳性单元表示包含目标DNA分子。阴性单元则表示没有目标DNA分子。在检测食品中的大肠杆菌O157和沙门氏菌等致病菌时，dPCR能在样品背景DNA干扰较大的情况下，提供准确可靠的定量结果。利用传统PCR和qPCR处理复杂食品基质时，往往易受到抑制剂和非特异性扩增的干扰；而dPCR能通过分散和独立扩增，显著降低这些干扰因素的影响，提高检测的准确性。

　　3.3多重PCR（Multiplex PCR）

　　多重PCR（Multiplex PCR）通过在反应体系中使用多对引物，能够同时扩增多个目标DNA序列，提高检测效率和信息量，确保在一次反应中能够获得更多的遗传信息。该项技术的核心在于引物设计的复杂性和反应条件的优化，以确保每对引物都能在同一反应体系中高效、特异性地扩增其对应的目标序列，从而减少反应次数，节约时间和成本，降低操作过程中的误差和污染风险。在食品微生物检测中，利用多重PCR技术可同时针对多种目标序列设计特异性引物，提高对复杂样品中微生物的检测灵敏度。例如，对于多种微生物污染的肉制品、乳制品或蔬菜样品，多重PCR能够同时检测出多种致病菌的存在，并提供全面的微生物污染信息，从而帮助企业及时发现并解决潜在的微生物污染问题。

　　4 PCR技术在食品微生物安全检测中的优化策略

　　4.1引物设计的优化

　　在食品微生物检测中，需要针对多种致病菌设计特异性引物，以深入了解目标微生物的基因组序列。例如，利用生物信息学工具（如BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）等），在设计引物前对目标序列进行比对分析，确保引物只与目标微生物的特定基因区域结合，不与其他微生物或宿主DNA发生非特异性结合；使用在线引物设计工具（如Primer3或OligoCalc等），自动化引物设计过程，提供更精确的引物序列[4]。另外，优化引物设计时，引物的长度应在18~24个碱基之间，以确保其与目标DNA序列的特异性结合；同时引物序列中应包含40%~60%的GC含量，以保证引物在反应温度下的稳定性和结合效率，确保在设计引物时，通过实验验证和优化，能够有效提高引物的实际性能。

　　4.2扩增条件的优化

　　在食品微生物安全检测中，优化退火温度、扩增循环数等扩增条件，有利于提高反应特异性和灵敏度。退火温度应根据引物的熔解温度（melting temperature，Tm）来优化，通常比引物的Tm低3~5℃。通过梯度PCR实验，可确定最佳的退火温度，确保引物与目标DNA序列的高效结合。合适的退火温度能确保引物只与目标序列特异性结合，避免非特异性扩增。另外，30~40个循环数是大多数PCR反应的标准，但具体的循环数还需根据目标DNA的初始量和扩增效率进行调整。在初始DNA量较低的情况下，适当增加循环数可提高检测灵敏度，但应避免过度循环，因为过多扩增循环容易导致非特异性产物的积累和PCR产物的板结效应，从而影响检测结果的准确性。

　　4.3样品前处理的优化

　　样品的均质化处理是通过机械破碎、研磨或化学处理等方法，使样品中的微生物均匀分布，确保后续提取步骤的有效性。例如，对于肉类和蔬菜等固体食品样品，可使用均质器或研钵进行充分研磨，使样品均质化，从而提高微生物检测的代表性和一致性。另外，多种提取和纯化方法的组合使用，可进一步提高样品前处理的效果。具体而言，在提取微生物DNA时，可先使用酶解或化学试剂裂解细胞壁，后进行物理破碎，以确保彻底释放DNA。随后，结合磁珠法与硅胶膜柱法进行双重纯化，去除可能残留的PCR抑制剂，提高DNA纯度和浓度。在此过程中，对于特定食品基质中的特殊成分（如高脂肪含量的奶制品或含有高多酚的果蔬样品等），可在前处理步骤中增加特异性的清除步骤（如使用脂类清除剂或多酚吸附剂等），以确保最终提取的DNA适合PCR扩增。

　　5结论

　　本文基于PCR技术和食品微生物检测的基本理论，分析了PCR技术在食品微生物检测领域的优势；从实时荧光定量PCR、数字PCR和多重PCR三方面入手，探讨了PCR技术在食品微生物检测中的应用；并从引物设计的优化、扩增条件的优化、样品前处理的优化出发，提出了PCR技术在食品微生物检测中的优化策略，提高了检测结果的准确性。

　　［1］王静怡,牛会敏,蒋静,等.探究PCR技术及其在食品微生物检测中的应用［J］.食品安全导刊,2020(12):164.

　　［2］田妍.食品微生物检测技术在食品安全检测中的应用［J］.食品安全导刊,2024(18):163-165.

　　［3］胡弘宇,马慧丽.PCR技术及其在食品微生物检测中的应用［J］.现代食品,2020(6):95-96.

　　［4］周宇晨,耿思缘,宋春璐,等.食品微生物检测中PCR技术的应用探索［J］.食品安全导刊,2022(20):187-189.