摘要：为探究根皮素（Phloretin，Ph）及根皮素/羟丙基-β-环糊精包合物（Ph/HBC-IC）对甲基乙二醛（MGO）诱导的人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）损伤的保护效果，文章采用冷冻干燥法制备得到Ph/HBC-IC，并利用傅里叶红外光谱（FTIR）、扫描电镜（SEM）、X射线衍射（XRD）等技术对包合物进行表征；通过CCK-8法检测细胞活力，筛选得到MGO诱导ARPE-19细胞损伤的最佳质量分数、Ph及Ph/HBC-IC的最佳干预质量分数，并考察了Ph及Ph/HBC-IC对MGO诱导ARPE-19细胞损伤的保护效果。研究结果显示，上述三种表征方式均能直接或间接证明包合物的形成；建立细胞损伤模型的最佳浓度是1 mmol/L MGO，且Ph及Ph/HBC-IC在0~15 mg/L的质量浓度范围内对细胞存活率没有显著影响。进一步研究表明，诱导的ARPE-19细胞经15 mg/L Ph及Ph/HBC-IC预处理后，细胞存活率分别提高了20.4%和28.67%，证实了Ph及Ph/HBC-IC对MGO诱导的细胞损伤具有保护作用，且Ph/HBC-IC对细胞的保护效果更好。研究结果为Ph及Ph/HBC-IC在相关领域的开发应用提供了科学依据。

　　关键词：根皮素；包合物；甲基乙二醛；人视网膜上皮细胞（ARPE-19）；保护效果

　　近些年，“抗糖”一词频繁出现在大众视野中。中老年糖尿病患者人数不断攀升且呈现发病年轻化趋势，患病人群不得不时刻关注抗糖以维持自身的健康水平。同时，中青年人群也开始意识到了抗糖的重要性，期望达到抗衰老的效果。人体在长时间处于高浓度还原糖环境中时，还原糖会与蛋白质反应生成有毒的中间化合物，如甲基乙二醛（MGO）和乙二醛（GO）等。这些中间产物一旦形成，不仅会对细胞产生毒性，还会进一步诱导晚期糖基化终产物（AGEs）的形成[1]。AGEs的形成是一个复杂的生物化学过程，可能会加剧细胞损伤，进而危害人体健康。相关研究表明，糖尿病、自然衰老和慢性炎症等情况会促进AGEs的形成和积累[2-4]，而AGEs积累会加剧眼睛、肾脏及血管等部位的糖尿病并发症[1]。研究发现，通过捕获MGO和GO，能够限制AGEs的形成，减轻其对细胞的毒性，可作为长期有效预防糖尿病并发症的基础和途径[5]。

　　根皮素（Phloretin，Ph）是一种天然黄酮类化合物，主要存在于人类经常食用的多汁水果或蔬菜的果皮和根皮中。该种物质具有多种生物活性，包括抗氧化[6-8]、抗菌[9-10]、抗炎[11-12]等。相关研究表明，根皮素能够抑制胰腺癌[13]、乳腺癌[14]、口腔癌[15]等癌细胞的生长。此外，其在提高胰岛素敏感性[16]、调节葡萄糖稳态[17]、缓解糖尿病[18]等方面也展现出了一定的潜力。然而，根皮素的不稳定性及其较差的水溶性限制了其在食品、药品、化妆品等领域的开发利用。为克服相关局限性，现有研究者探索了多种方法及策略。其中，环糊精包合物因能有效改善生物活性化合物的溶解度、稳定性、渗透性而备受关注。特别是羟丙基-β-环糊精（2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin,HBC），因具有更高的水溶性、更低的毒性、更强的络合能力[19]而被优先考虑。相关研究也证实了通过HP-β-CD包合Ph形成根皮素/羟丙基-β-环糊精包合物（Phloretin/2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin in-clusion complex，Ph/HBC-IC），不仅能显著提升Ph的水溶性，还能进一步增强其抗氧化性能[20]。

　　Ph及Ph/HBC-IC在多个领域展现出了较大的应用潜力，但目前尚未有关于Ph/HBC-IC对细胞的固有毒性，及其对MGO诱导的ARPE-19细胞损伤的保护效果等方面的研究报道。为此，文章成功制备了Ph/HBC-IC，并对其进行了表征，利用CCK-8法探索了Ph及Ph/HBC-IC对细胞的固有毒性，并重点考察了其对MGO诱导ARPE-19细胞损伤的保护效果。研究结果将为Ph及Ph/HBC-IC的安全性和有效性评估提供重要的科学依据。

　　1材料与方法

　　1.1材料与试剂

　　根皮素（纯度≥98%），西安洛神生物科技有限公司；羟丙基-β-环糊精、无水乙醇、甲基乙二醛、二甲基亚砜，均购自上海泰坦科技股份有限公司；ARPE-19细胞株，上海誉弛生物科技有限公司；DMEM/F12（1∶1）培养基、青-链霉素混合液（100×)、CCK-8试剂盒、PBS缓冲液，均购自北京兰杰柯科技有限公司；四季青胎牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司；GIBCO胰蛋白酶，美国Thermo Fisher公司。

　　1.2仪器与设备

　　PB303-S/FACT电子天平，美国Mettler Toledo公司；XM-400ULF超声波清洗仪，小美超声仪器；DF-101Z集热式磁力搅拌器，上海析牛莱伯仪器有限公司；Scientz-25T真空冻干机，宁波新芝生物科技股份有限公司；JSM-IT500HR扫描电子显微镜，日本JEOL公司；Nicolet iS50傅里叶红外光谱仪，美国Thermo Fisher公司；D8 ADVANCE X射线衍射仪，德国布鲁克；LRH-70生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；SW-CT-2D超净工作台，苏州净化公司；SpectraMaxM2酶标仪，美国Molecular De-vices公司；Centrifuge 5424离心机，德国Eppendort公司。

　　1.3试验方法

　　1.3.1包合物的制备方法

　　采用冷冻干燥法制备包合物。先称取适量HBC溶于30 mL去离子水中，再将适量Ph溶于5 mL无水乙醇中，边超声处理边搅拌直至完全溶解。将Ph-无水乙醇溶液缓慢滴加到HBC水溶液中，并持续超声20 min；将混合液转移至磁力搅拌器上，30℃搅拌3 h，完毕后自然冷却至室温，进行过滤处理，并将滤液放置在-20℃环境中冷冻48 h。最后放入冷冻干燥机中进行干燥处理，干燥至恒重，得到松散的包合物粉末。

　　1.3.2包合物的表征

　　1.3.2.1 FTIR分析

　　取适量Ph、HBC、物理混合物以及Ph/HBC-IC，并将其分别与KBr混合、压片。处理完成后，放入红外光谱仪中，在4 000~400 cm-1扫描范围内进行红外光谱测定。

　　1.3.2.2 SEM分析

　　取适量Ph、HBC、物理混合物以及Ph/HBC-IC，将其处理均匀后分别涂布于导电胶上，随后放入喷金仪中喷金使其具有导电性，并将喷金处理后的样品放入SEM中，通过调节相应参数来观察样品的形貌。

　　1.3.2.3 XRD分析

　　采用Cu-Kα射线，在管电压40 kV、管电流40 mA的条件下对Ph、HBC、物理混合物以及Ph/HBC-IC展开XRD分析。所有样品均在2θ的衍射范围内进行测量，范围为10~50 o，扫描速率为4 o/min。

　　1.3.3细胞培养

　　将ARPE-19细胞置于DMEM/F12（1∶1）培养基（含10%胎牛血清、1%青-链霉素混合液）中培养，并在37℃、5%CO2的培养箱中孵育，每2 d更换一次培养液，待细胞汇合度达到70%~80%时，进行传代培养。传代比例为1∶3，取对数生长期细胞开展后续实验。

　　1.3.4 MGO诱导ARPE-19细胞损伤最适质量浓度的确定

　　设置实验组和对照组，将ARPE-19细胞按照每孔约1×104个细胞的密度接种于96孔板中，且每组均设置3个复孔。将细胞置于培养箱中培养24 h后，弃去完全培养基。对照组仅加入无血清培养基；实验组则加入用无血清培养基稀释的不同质量分数的MGO溶液。继续培养24 h后，弃去培养基。随后，以换液的形式向每孔中加入用无血清培养基稀释的10%CCK-8溶液，并设置仅含有CCK-8试剂的空白对照组。将孔板放入培养箱中反应约1 h，并使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的吸光度值。细胞存活率的计算如式（1）所示。

　　式中：A0为空白组的吸光度值，即仅含有培养基及CCK-8时的吸光度值；A1为对照组的吸光度值，即未经化合物处理的细胞的吸光度值；A2为实验组的吸光度值，即经过不同质量分数化合物处理的细胞的吸光度值。

　　1.3.5 Ph、HBC及Ph/HBC-IC对ARPE-19细胞的毒性作用

　　设置实验组和对照组，将ARPE-19细胞按照每孔约1×104个细胞的密度接种于96孔板中，且每组均设置3个复孔。将细胞置于培养箱中培养24 h后，弃去完全培养基。对照组仅加入无血清培养基；实验组则加入用无血清培养基稀释的不同质量浓度的Ph、HBC及Ph/HBC-IC溶液（稀释前可用少量二甲基亚砜溶解）。继续培养24 h后，弃去培养基。随后，以换液的形式向每孔中加入用无血清培养基稀释的10%CCK-8溶液，并设置仅含有CCK-8试剂的空白对照组。将孔板放入培养箱中反应约1 h，并使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的吸光度值。根据公式（1）计算细胞存活率。

　　1.3.6 Ph及Ph/HBC-IC对ARPE-19细胞的保护作用

　　设置实验组、对照组和模型组，将ARPE-19细胞按照每孔约1×104个细胞的密度接种于96孔板中，且每组均设置3个复孔。将细胞置于培养箱中培养24 h后，弃去完全培养基。对照组仅加入无血清培养基；模型组仅加入1 mmol/L的MGO溶液；将实验组细胞用不同质量分数的化合物孵育3 h后与1 mmol/L的MGO共处理，继续培养24 h后，弃去培养基。随后，以换液的形式向每孔中加入用无血清培养基稀释的10%CCK-8溶液，并设置仅含有CCK-8试剂的空白对照组。将孔板放入培养箱中反应约1 h，并使用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的吸光度值。根据公式（1）计算细胞存活率。

　　2结果与分析

　　2.1包合物的表征

　　2.1.1 FTIR结果分析

　　红外光谱法主要通过吸收峰的波长、强度来判断分子中存在的基团，是表征常用的方法之一。Ph、HBC、物理混合物及Ph/HBC-IC的红外光谱图如图1所示。

　　由Ph红外光谱图可知，在1 515 cm-1、1 529 cm-1处出现的是苯环伸缩振动吸收峰；1 605 cm-1、1 630 cm-1处出现的是C=C、C=O的拉伸振动吸收。通过HP-β-CD的光谱图可以观察到，在1 030 cm-1、1 084 cm-1、1 156 cm-1处有很强的吸收峰，这与C-O的拉伸振动有关；1 629 cm-1处出现了H-O-H弯曲振动峰；2 935 cm-1吸收峰与C-H伸缩振动有关；3 415 cm-1处出现的是-OH振动吸收峰。

　　物理混合物的光谱图只是单个组分吸收光谱的叠加，与HBC的光谱图十分相似。这是因为HBC与Ph分子的吸收在大部分光谱区域都是重叠的，同时Ph/HBC-IC光谱图也与HBC的光谱图基本一致。此外，通过物理混合物光谱图还可以看到，1 515 cm-1处有芳香环的特征峰，而此峰在Ph/HBC-IC的光谱图中并不存在。上述结果表明，Ph被包埋在HBC分子的空腔内，并形成了包合物。

　　2.1.2 SEM结果分析

　　通过扫描电子显微镜观察物质微观形貌，能够辅助表征包合物的形成。Ph、HBC、物理混合物及Ph/HBC-IC的SEM结果如图2所示。

　　从图2a可以看出，Ph的形态是不规则、呈细长条状的晶体结构；从图2b观察到，HP-β-CD呈现出了具有不同大小空腔结构的球形颗粒形态；通过图2c可以观察到大小不一的块状结构且有刺条状的Ph及部分破碎HBC的存在；图2d中Ph/HBC-IC呈现出小且均匀的团状晶体结构，且与Ph及HBC的表观存在显著差异。由此可以推断，这两种物质之间产生包和作用形成了包合物。

　　2.1.3 XRD结果分析

　　XRD是表征包合物一种常用的研究方法。Ph、HBC、物理混合物及Ph/HBC-IC的XRD图谱如图3所示。

　　从XRD图谱可以看出，a-Ph在18.08、19.18、27.41、28.29的衍射角处出现了几个尖峰，表明其是以结晶态存在的；b-HBC的衍射峰仅为一条宽峰，缺乏结晶峰，表现出了无定形结构形式；c-物理混合物既具有HBC无定形的结构特征，又有Ph的结晶峰，这可能是两个样品的叠加，没有产生新的晶体；与此相反，d-Ph/HBC-IC的XRD图谱与HBC的XRD图谱基本一致，没有任何与Ph相对应的衍射峰，表明Ph已被成功包埋到了HBC空腔中，失去了结晶度。上述结果在一定程度上证实了包合物的形成。

　　2.2 MGO诱导ARPE-19细胞损伤最适浓度的选择

　　为验证Ph及Ph/HBC-IC对ARPE-19细胞的保护作用，需要先筛选出MGO造成细胞损伤的最适质量分数。不同质量分数MGO对ARPE-19细胞存活率的影响具体如图4所示。

　　数据显示，细胞经不同浓度的MGO处理24 h后，细胞存活率随MGO浓度升高而呈现出了下降趋势。当MGO浓度为1 mmol/L时，细胞存活率从对照组的101%±1.86%下降至62.55%±1.73%，表明此时的MGO浓度对细胞造成了中度损伤。因此，选择1 mmol/L的MGO浓度开展后续实验。

　　2.3 Ph、HBC及Ph/HBC-IC对ARPE-19细胞的毒性作用

　　为筛选出适合后续实验的Ph及Ph/HBC-IC质量分数，需要评估其对ARPE-19细胞的固有毒性。将细胞用不同质量分数的Ph、HBC及Ph/HBC-IC进行处理，并测定相应的细胞存活率，以确定不会对细胞产生显著影响的质量浓度范围。不同质量浓度Ph、HBC及Ph/HBC-IC对ARPE-19细胞存活率的影响具体如图5所示。

　　结果表明，HBC在5~100 mg/L质量浓度范围内无细胞毒性；与未经处理的对照组细胞相比，用质量浓度5、10、15 mg/L的Ph及Ph/HBC-IC处理对ARPE-19细胞存活率没有显著影响，表明在这些质量分数范围内，Ph及Ph/HBC-IC对细胞没有明显的毒性。随着质量分数不断提高，细胞存活率逐渐下降；当Ph和Ph/HBC-IC的质量浓度达到100 mg/L时，细胞存活率分别下降至10.96%±2.42%和15.88%±3.34%，意味着高质量浓度的Ph及Ph/HBC-IC对ARPE-19细胞具有显著毒性。因此，Ph及Ph/HBC-IC适合在0~20 mg/L的质量浓度范围内使用，且不必担心其固有的毒性作用。此外，还观察到在同一质量浓度下，Ph/HBC-IC对细胞的固有毒性要小于Ph，这与现有研究的结果相似[21,22]。推测其原因，可能是通过将Ph包裹在HBC的空腔内，可减少Ph在细胞外或细胞膜上的非特异性结合和相互作用，从而降低Ph对细胞的潜在损害。

　　2.4 Ph及Ph/HBC-IC对MGO诱导的ARPE-19细胞损伤的保护作用

　　根据上述实验结果，选择1 mmol/L的MGO与5、10、15 mg/L 3个质量浓度的Ph及Ph/HBC-IC开展后续实验。Ph及Ph/HBC-IC对MGO损伤ARPE-19细胞存活率的影响如图6所示。

　　数据显示，与对照组相比，单独使用1 mmol/L的MGO进行细胞处理后，细胞存活率显著降低，由原来的100%下降至62.55%±1.73%，而若先将细胞用5、10、15 mg/L质量浓度的Ph及Ph/HBC-IC进行预处理，再与1 mmol/L的MGO共同处理，细胞存活率得到了显著提升。特别是当Ph及Ph/HBC-IC质量浓度达到15 mg/L时，细胞存活率较模型对照组分别提高到了82.95%±2.43%和91.22%±4.12%；与模型组相比，细胞存活率分别提高了20.4%和28.67%。上述结果表明，Ph及Ph/HBC-IC预处理降低了MGO对ARPE-19细胞的毒性。这是因为在一定条件下，Ph及Ph/HBC-IC能够快速捕获MGO[23]，从而对ARPE-19细胞起到保护作用。值得注意的是，如图所示，Ph/HBC-IC对细胞的保护作用在一定程度上要强于Ph。究其原因，其一，相关研究表明，MGO是通过升高ARPE-19细胞的氧化应激水平来引起细胞损伤的[24]，而Ph/HBC-IC的抗氧化活性显著强于Ph[20]，从而使Ph/HBC-IC对细胞具有更好的保护作用；其二，包合物在一定条件下可能会解离成Ph和HBC。其中，Ph能够捕获MGO，同时HBC也能对MGO起到一定的包合作用。两种情况叠加，可以增强Ph/HBC-IC对细胞的保护作用。查阅相关国内外文献，并未发现对该种情况的研究探讨。因此，后续或可合理设计一系列试验来验证这一猜想正确与否。

　　3结论

　　文章采用冷冻干燥法制备得到了Ph/HBC-IC，并利用FTIR、SEM、XRD等手段对包合物进行表征，证实了包合物的形成。同时，通过CCK-8法检测细胞活力，成功构建了MGO诱导的ARPE-19细胞损伤模型，并评估了Ph及Ph/HBC-IC对细胞的固有毒性。结果显示，经包合的Ph的固有毒性显著低于Ph。根据上述结果，文章进一步探讨并证实了Ph及Ph/HBC-IC对MGO诱导的细胞损伤均具有明显的保护效果，且Ph/HBC-IC对细胞的保护效果要强于Ph本身。这一结论为Ph/HBC-IC的安全使用提供了可靠的数据支持，也为其作为抗糖药物及护肤品原料的开发和应用提供了更多可能性。

　　然而，文章仅对Ph及Ph/HBC-IC的保护效果进行了初步判断与探讨，尚未深入研究其具体的细胞保护机制。未来研究还需进一步围绕其作用机制展开探索，从而为扩大其应用范围提供全面的理论依据。

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