摘要：文章对高凝胶强度可得然胶的发酵过程、提取工艺进行优化研究。结果表明，发酵过程的最佳碳源与氮源选择分别是蔗糖、（NH4）2HPO4；可得然胶产率达到最大值55 g/L时，最佳的发酵条件是蔗糖质量浓度50 g/L、（NH4）2HPO4质量浓度2 g/L、发酵温度30℃;综合使用多种方案的纯化提取工艺，得到可得然胶产品最适宜干燥温度为40~45℃,干燥方式为真空干燥。该工艺可实现可得然胶的工业化生产，并使产品性能受到市场的广泛认可。

　　关键词：可得然胶；发酵；工艺；优化

　　可得然胶是一种天然的、不溶于水的胞外多糖，又被称为凝胶多糖，具有三螺旋的特殊结构，在加热条件下可形成具有保水性、成膜性、增稠性等特性的凝胶。将其添加进饲料中，可促进益生菌增殖，且其良好的生物相容性使其可作为药物载体，在食品、农业、生物医药等领域得到广泛应用[1-3]。

　　自可得然胶被发现以来，其发酵法生产得到了学者的广泛研究，涵盖发酵培养基的选择和优化、发酵条件的调控、生物反应器的改良、菌株的改造等。此外，可得然胶由β-1，3-葡萄糖残基线性连接而成，只溶解于碱性水溶液中，生成过程受温度影响极大[4]。因此，亟须探索一条科学合理的生产工艺路线，以提高产品质量，降低成本。

　　本研究主要分为以下两部分：优化可得然胶发酵培养基的重要条件，并对发酵结果的重要影响因素进行单因素实验，最终确定最佳的可得然胶培养基配方；探索提取及干燥工艺对可得然胶性能的影响。

　　1设备与方法

　　1.1方法

　　1.1.1菌种制备

　　固体培养基（10 g/L）：蔗糖10、酵母膏2、蛋白胨4、氯化钠2、琼脂20；pH 7.0；121℃灭菌20 min，温度28~30℃;将固体培养基加入培养皿中，冻藏菌种接种入培养皿中，活化70 h。

　　1.1.2种瓶制备

　　种子培养基（g/L）：蔗糖20、（NH4）2HPO4 1、KH2PO4 1.5、七水硫酸镁1、轻质CaCO3 3、玉米浆干粉1.5；pH 7.0。将培养基中的菌接入已灭菌的1 L培养基中，30℃、210 r/min培养20 h。

　　1.1.3一级种子罐

　　种子培养基（g/L）：蔗糖20、酵母粉3、KH2PO4 1.5、七水硫酸镁1、CaCO3 3；pH 7.0。接种量1%，30℃,pH自然，培养15~20 h。

　　1.1.4二级种子罐

　　种子培养基（g/L）：蔗糖20、酵母粉5、（NH4）2HPO4 5、KH2PO4 1.5、七水硫酸镁1、CaCO3 3；pH 7.0，121℃灭菌20 min。接种量5%，30℃,搅拌频率200 Hz，通气比0.4 vvm，pH自然，培养15~20 h，OD600=15~20。

　　1.1.5发酵罐

　　发酵培养基（g/L）：蔗糖50、CIH4N 2、KH2PO4 2、七水硫酸镁1、CaCO33、大豆油1；pH 7.0，121℃灭菌20 min。接种量5%，30℃,搅拌频率200 Hz，通气比0.4 vvm，pH自然，培养60~65 h，凝胶强度出现下降或残糖低于5%时放罐。

　　1.1.6提取

　　发酵液→陶瓷膜过滤（50 nm）→一次醇洗（75%乙醇搅拌1 h）→板框过滤→二次醇洗（搅拌75%乙醇30 min，调整浓度至85%再搅拌1 h）→板框过滤→真空耙式干燥机（干燥至水分达到3%以下）→气流颗粒粉碎机粉碎→包装。

　　1.2设备

　　所用设备：金属探测仪（上海自动化仪器设备有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；奥林匹斯生物显微镜（日本东京奥林巴斯）；旋转式黏度计（上海越平仪器厂）；雷磁pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；电子天平（上海精密科学仪器厂）；生物分析传感仪（山东省科学研究院）；电热真空干燥箱（北京永光明医疗器械厂）；凝胶强度仪（CT3-4500）。

　　1.3分析方法

　　1.3.1可溶性残糖（g/L）

　　使用生物分析传感仪测得可溶性残糖含量。

　　1.3.2凝胶强度

　　将发酵液搅拌均匀，取适量倒入容量500 mL的烧杯中，以玻璃棒搅拌均匀，置于沸水中加热10 min，取出后冷却30 min。精准测量1 g的凝胶于质构仪下的检测结果。

　　2结果与分析

　　2.1发酵培养基的优化

　　2.1.1不同碳源对可得然胶产率的影响研究

　　碳源是合成可得然胶不可或缺的成分。合适的碳源对可得然胶的合成具有重要影响。

　　在其他条件保持不变的情况下，进行比较实验。结果显示，在可利用的碳源（蔗糖、葡萄糖、玉米淀粉、红薯淀粉、乳糖、麦芽糖）中，碳源为蔗糖、葡萄糖的培养基发酵产率较好，可得然胶的最高产率分别达到55 g/L、45 g/L；碳源为玉米淀粉、红薯淀粉、乳糖、麦芽糖时，可得然胶产率分别为27 g/L、30 g/L、38 g/L、26 g/L。根据实验最终确定蔗糖为最佳碳源。

　　以蔗糖为发酵培养基碳源，其他条件不变，调整碳源质量浓度进行实验，结果如表1所示。蔗糖质量浓度在50 g/L时发酵产率最高；质量浓度低于50 g/L时，碳源消耗过快，会影响可得然胶的进一步合成；当质量浓度高于50 g/L时会抑制菌体生长。综合50 g/L蔗糖的残糖含量较低，转化率可被接受。因此，选用50 g/L的蔗糖作为初始碳源。

　　2.1.2不同氮源对可得然胶产率的影响研究

　　在其他条件相同的情况下，对最佳氮源及其质量浓度进行实验。以发酵产率为指标，实验结果显示，CIH4N、NH4NO3、（NH4）2SO4、酵母粉的可得然胶产率分别为45 g/L、43 g/L、40 g/L、38 g/L。在（NH4）2HPO4作为氮源的情况下，发酵产率最高可达55 g/L，且相对于有机氮源酵母粉，其他无机氮源的培养基发酵产率更高。因此，可将（NH4）2HPO4作为首选氮源。

　　将（NH4）2HPO4确定为可得然胶发酵培养基的无机氮源后，需要进一步确定最佳氮源质量浓度。实验结果如表2所示。（NH4）2HPO4质量浓度为2 g/L时，可得然胶的产率可达到最大值55 g/L。氮源质量浓度较低时，菌体细胞量较少，可得然胶发酵产率低；随着氮源质量浓度增加，碳氮比数值减小，菌体细胞生长变快，碳源消耗过大，不利于产品合成。综合来看，质量浓度为2 g/L的（NH4）2HPO4的生物量相对较高，残糖含量低。因此，选用2 g/L（NH4）2HPO4作为初始氮源。

　　2.1.3发酵温度对可得然胶产率的影响研究

　　微生物细胞的正常生长需要具备特定的恒温条件。通过设计梯度实验，探究适宜的发酵温度。将温度选择区间设定为26~34℃,梯度为2℃。

　　在其他条件保持不变的情况下，实验结果显示：发酵温度为26、28℃时，可得然胶的产率分别为45 g/L、52 g/L；发酵温度为30℃时，可得然胶的产率达到最大，为55 g/L；温度为32、34℃时，产率为50 g/L、43 g/L。可见，温度过高会影响代谢过程。因此，最宜发酵温度为30℃。

　　2.1.4正交实验筛选最佳发酵配方条件

　　以蔗糖质量浓度、（NH4）2HPO4质量浓度、发酵温度为本次正交实验的三因素，分别记作A、B、C，各因素均取三个水平。因素与水平表见表3所示。

　　2.1.4.1正交实验方案与实验结果

　　选用L9（34）正交表进行实验设计。实验方案与实验结果如表4所示。

　　2.1.4.2实验结果分析

　　实验结果分析如表5所示。结论：对比表4、表5可知，根据上述9个实验显示的结果，发现实验5产胶水平最高，其组合为A2B2C2，分别是各因素中影响最大的水平，而R值大小表明本实验因素存在显著性顺序排列，主次关系为A>B>C，表明可得然胶产率最主要的影响因素为蔗糖质量浓度，其次是（NH4）2HPO4质量浓度，最后是发酵温度。

　　通过正交实验可得，在其他条件保持不变的情况下，实验最佳条件为：蔗糖质量浓度50 g/L，（NH4）2HPO4质量浓度2 g/L，发酵温度30℃。

　   2.2可得然胶提取及干燥工艺研究

　　2.2.1不同提取工艺对可得然胶成胶性能的影响本文列举三种工艺路线的优缺点，如表6所示。

　　凝胶强度是衡量可得然胶品质的一个重要指标。本实验对可得然胶的提取工艺参数进行优化，获得可得然胶精品，凝胶强度为750 g/cm2。工艺路线如下。

　　发酵液加入0.5 BV NaOH溶液溶解→陶瓷膜过滤（除菌）→加水加0.5 N盐酸→一次乙醇沉降→过滤→二次乙醇沉降→过滤→真空干燥→粉碎→成品包装。工艺技术的优化提高了可得然胶的凝胶强度，为后续工业化进程中高强度可得然胶的生产奠定了良好基础。

　　2.2.2不同的干燥方式、温度对可得然胶成胶性能的影响

　　如图1所示，探究4种干燥方法对可得然胶成品凝胶强度的影响。研究发现，冷冻干燥产品的成胶性能较好，能达到820 g/cm2，但生产成本高、产量小；在40℃和45℃真空干燥方法下得到的产品凝胶强度（750 g/cm2、663 g/cm2）较高，但相较于冷冻干燥略有下降；当温度高于50℃时产品凝胶强度急剧下降；不同温度下烘箱干燥产品的凝胶强度普遍不高，难以满足产品在食品及其相关领域的应用。综上所述，宜用低温（40~45℃)真空干燥方式进行可得然胶产品的干燥工作。

　　2.3产品检测

　　本文对可得然胶的干燥工艺参数进行优化，在适宜条件下获得可得然胶精品，凝胶强度为750 g/cm2，且试制获取的可得然胶产品的各项技术指标均已达到国家标准GB 28304-2012《食品添加剂可得然胶》。其工艺路线如下。

　　发酵液加入0.5 BV NaOH溶液溶解→陶瓷膜过滤（除菌）→加水加0.5 N盐酸→一次乙醇沉降→过滤→二次乙醇沉降→过滤→真空干燥→粉碎→成品包装。

　　通过多方案、多流程的纯化提取，研究得到可得然胶产品最适宜的干燥温度为40~45℃、干燥方式为真空干燥。采用该工艺路线可以实现可得然胶的工业化连续生产，且产品性能也将得到市场认可。

　　3结论与讨论

　　经过对发酵培养基、可得然胶提取及干燥工艺的优化研究，可知可得然胶的最佳发酵条件为蔗糖质量浓度50 g/L，（NH4）2HPO4质量浓度2 g/L，发酵温度30℃。在适宜条件下获得的可得然胶精品，凝胶强度可达到750 g/cm2，且最佳干燥温度为40~45℃、干燥方式为真空干燥。

　参考文献

　　［1］张永刚,吉武科,武琳,等.可得然胶凝胶性能影响因素的研究［J］.化学与生物工程,2013,30(8):54-56.

　　［2］李璐,丁昊,霍栓,等.可得然胶与变性淀粉对鲶鱼鱼糜凝胶特性的影响［J］.天津科技大学学报,2023,38(5):8-14.

　　［3］刘晓霞.土壤杆菌产可得然胶发酵工艺优化及其性质的研究［D］.上海:华东师范大学,2017.

　　［4］李辉,周燕燕.盐酸处理对可得然胶品质提升试验研究［J］.辽宁化工,2023,52(9):1299-1302.