摘要：为研究甘肃定西市传统发酵食品浆水和甜醅中酵母菌的种类，文章采用纯培养方法对酵母菌进行了分离和纯化，并根据PDA平板上的菌落特征以及显微细胞形态和生理生化特性，对酵母菌进行了初步鉴定，同时结合菌株26S rDNA的序列分析，开展了种属鉴定。试验从两种发酵食品中共分离出32株酵母菌，分18个属，包括Pichia、Geotrichum、Zygoascus、Starmera、Wickerhamiella、Saccharomyces、Wickerhamomyces、Debaryomyces、Hanseniaspora、Kluyveromyces、Cutaneotrichosporon、Millerozyma、Candida、Rhodotorula、Cyberlindnera、Metschnikowia、Torulaspora、Clavispora。研究发现，甘肃定西浆水和甜醅中的酵母菌种类丰富，对这两类发酵食品的品质和口味具有重要作用。

　　关键词：发酵食品；浆水；甜醅；酵母；菌种

　　浆水和甜醅因口感独特而深受西北人民喜欢。浆水是先将蔬菜等煮熟加热，再投以面汤和“酵子”（也称引子，为老浆水）后自然发酵而成的酸性食品[1-2]；甜醅是以小麦、燕麦或青稞为原料，经甜酒曲在微生物发酵下制作而成的传统特色小吃[3]。已有研究表明，这两类发酵食品中的优势菌群为乳酸菌和酵母菌[1-3]。其中，酵母菌在发酵过程中主要起改善食品风味和品质、产生酒精、增加酯类物质的含量等作用[4]。

　　目前，对浆水中微生物的研究仍聚焦在乳酸菌的分离和功能特性方面[2]，而对酵母菌的系统分类研究则较少，同时对甜醅的研究报道也较为匮乏，且以工艺优化和营养成分分析为主[5]，鲜有对甜醅中微生物菌群系统展开研究。鉴于酵母菌种类在不同发酵食品、不同产区和发酵环境下具有一定差异[4]，本文以甘肃定西市浆水和甜醅为研究材料，对参与发酵的酵母菌进行分离和鉴定，并分析这两类食品中的酵母菌种类，以期为酵母菌在浆水和甜醅发酵过程中的优化应用提供数据参考。

　　1材料与方法

　　1.1材料与试剂

　　1.1.1样品来源

　　从甘肃省定西市采集家庭自制浆水样品10份；甜醅样品9份。

　　1.1.2培养基和试剂

　　马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），北京陆桥生物科技有限公司；葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖、核糖、鼠李糖（均为分析纯），上海麦克林生化科技有限公司。

　　糖发酵基础培养基：蛋白胨10g；蒸馏水1 000 mL，并按10 mL/管分装于含有倒置小管的试管中，121℃灭菌15 min。

　　1.2仪器与设备

　　MJ-350B智能型霉菌培养箱（上海琅玕试验设备有限公司）；EX30光学显微镜（宁波舜宇）；BAC-1300ⅡA2生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）。

　　1.3方法

　　1.3.1酵母菌的分离与纯化

　　采用平板划线法在PDA平板上挑取生长状况良好、不同形态的单菌落并进行反复分离纯化，同时观察并记录纯化菌株的形状、颜色、光滑度、边缘形状等特征；用结晶紫染色液进行单染色，并在光学显微镜下（100×物镜）观察菌体细胞的形态。

　　1.3.2酵母菌的鉴定

　　糖发酵试验：参照《酵母菌的特征与鉴定手册》[6]，将糖加入到糖发酵基础培养液中，使各类糖的终浓度为0.5%；将酵母菌株活化后接种至上述糖发酵培养液中，于28℃下培养2~5 d，观察小导管内是否有气泡产生；延迟反应则需观察10~15 d。

　　菌株的分子生物学鉴定：对酵母菌的26S rDNA序列进行扩增和测序，且引物为NL1和NL4的通用引物；将扩增产物经凝胶电泳检测后，送往生工生物工程（上海）股份有限公司测定序列。

　　2结果与分析

　　2.1菌株的分离纯化

　　通过PDA平板进行划线分离，并分别从浆水和甜醅中分离出13株和19株酵母菌疑似菌株。浆水中的菌株编号为JY-1~JY-13；甜醅中的菌株编号为TY-1~TY-19。

　　2.2菌株的鉴定

　　2.2.1菌株的形态特征

　　菌株在PDA平板上的菌落形态如表1所示。菌株特征多为圆形；颜色多呈白色、灰白色、乳白色，而TY-12菌落颜色较为特殊，呈胡萝卜色（见图1）；多数菌落表面光滑、边缘整齐，而TY-8菌落表面粗糙则呈褶皱状（见图1）。显微镜检观察到的细胞形态有卵圆形、椭圆形、圆形和腊肠状。其中，以椭圆形和卵圆形居多。

　　2.2.2菌株的生理生化特性

　　通过对菌株的生理生化测定发现，在糖发酵试验中，所有的疑似菌株均可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖；对核糖和鼠李糖的发酵性能较弱，且只有TY-1和TY-3分别具有发酵核糖和鼠李糖的能力；不同菌株对半乳糖、麦芽糖的发酵性能存在差异。具体结果如表2所示。

　　2.2.3菌株的分子生物学鉴定

　　将菌株的26S rDNA序列过NCBI数据库进行Blast同源性比对，并采用MEGA-X软件绘制系统发育树。经序列测定和分析，发现本研究分离出的32株菌株的26S rDNA序列与GenBank中序列的同源性在99%以上。结合所构建的系统发育树以及菌落形态和生理生化特性，可确定所分离的菌株均为酵母菌。其分属于18个不同属、20个不同种。菌属包括Pichia、Geotrichum、Zygoascus、Starmera、Wickerhamiella、Saccharomyces、Wickerhamomyces、Debaryomyces、Hanseniaspora、Kluyveromyces、Cutan-eotrichosporon、Millerozyma、Candida、Rhodotorula、C-yberlindnera、Metschnikowia、Torulaspora、Clavispora。具体如表3所示。

　　3讨论

　　和浆水中的乳酸菌相比，酵母菌的研究较为匮乏。现有研究表明，浆水中的真菌群落较细菌群落更为复杂[7]。向书娅等[8]采用高通量测序技术，发现甘肃天水、宁夏固原、陕西安康3个地区浆水中的真菌主要隶属于Dipodascus、伊Issatchenkia、Pichia和Wickerhamomyces等。李良凤[7]从陕西和甘肃浆水中分离出的酵母菌属为Candida和Trichosporon。

　　目前，对甜醅中菌群构成的研究报道较少。任菲等[3]利用高通量测序技术，发现西北部分甜醅样品中含有Saccharomycopsis、A piotrichum和Cyb-erlindnera。该发现与本研究分离鉴定的菌属一致。

　　4结论

　　本文从甘肃定西地区的传统发酵食品浆水和甜醅中共分离出32株酵母菌，属18个属。菌属包括Pichia、Geotrichum、Zygoascus、Starmera、Wi-ckerhamiella、Saccharomyces、Wickerhamomyces、De-baryomyces、Hanseniaspora、Kluyveromyces、Cutaneot-richosporon、Millerozyma、Candida、Rhodotorula、Cyb-erlindnera、Metschnikowia、Torulaspora、Clavispora。鉴定结果表明，甘肃定西地区浆水和甜醅中的酵母菌具有丰富的多样性。

参考文献

　　［1］李雪萍.浆水中可培养微生物多样性及特性的研究［D］.兰州:兰州交通大学,2014.

　　［2］WU Y,YE Z,FENG P Y,et al.Limosilactobacillus fermentum JL-3 isolated from“Jiangshui”ameliorates hyperuricemia by degrading uric acid［J］.Gut Microbes,2021,13(1):11-18.

　　［3］任菲,黎雯意,陈舒,等.燕麦甜醅真菌群落多样性及米根霉发酵对甜醅性质的影响［J］.粮油食品科技,2024,32(1):36-43,13.

　　［4］全昌彬,姚玉仙.贵州黔南地区泡制酸菜中酵母菌的分离与鉴定［J］.食品安全质量检测学报,2022,13(13):4273-4281.

　　［5］史晓萌,陈建国,党艳婷,等.响应曲面法优化燕麦甜醅发酵工艺的研究［J］.食品工业,2018,39(4):88-92.

　　［6］巴尼特,佩恩,亚罗.酵母菌的特征与鉴定手册［M］.青岛:青岛海洋大学出版社,1991.

　　［7］李良凤.浆水中益生菌群的研究及浆水发酵工艺的研究［D］.西安:陕西科技大学,2013.

　　［8］向书娅,翟茹,张海燕,等.不同地区发酵浆水中微生物群落结构比较及优势菌群的鉴定［J］.现代食品科技,2023,39(3):121-128.