摘要：应用新剂型制备技术可更深入地研究穿心莲内酯的药用价值。文章采用熔融乳化-超声-低温固化法制备穿心莲内酯纳米脂质载体，并优化工艺参数。结果表明，最佳条件为：单硬脂酸甘油酯和肉豆蔻酸异丙酯按1∶1比例复配，将吐温-80作为活性剂，药脂比值为1∶20，在75℃水浴下乳化60 min。该研究为开发穿心莲内酯提供了理论依据。

　　关键词：穿心莲内酯；纳米脂质载体；表征；工艺优化

　　穿心莲（Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees）属爵床科植物[1-2]，主要成分为穿心莲内酯（Andrographolide，AG）。AG具有广泛的药理作用，包括抗炎、抗菌、抗病毒等[3-4]。因此，深入开发AG，成为提升穿心莲药用价值的关键手段。目前上市的AG衍生物，大多通过成盐提高其溶解性，包括琥珀酸脱氢穿心莲内酯钠、琥珀酸脱氢穿心莲内酯钾和穿心莲内酯亚硫酸氢钠[5-6]。该类方法工艺复杂且周期较长，因此有必要开发新的AG制剂，如纳米脂质体（Nanostructured Lipid Carriers，NLCs）等。脂质体可将药物包裹在类脂双分子夹层中，达到良好的药物递送效果[7-9]。根据已有研究[10]，本文对AG与纳米脂质体进行了组装及优化，对固液脂质种类、表面活性剂种类、固液脂质比值、药脂比值、乳化时间、水浴温度等影响因素进行了调整，并对其不同制备工艺下的包封率、粒径等进行了测量，以得到制备AG纳米结构脂质体（AG-NLCs）的最佳制剂处方及工艺，同时还对其进行了外形、晶型、红外和热吸收等表征分析。

　　1实验内容

　　1.1实验仪器及试剂

　　主要实验仪器：高效液相色谱仪（Agilent1260，安捷伦）；马尔文粒度仪（Zetasizer Nano ZS，马尔文）；冷冻离心机（Eppendorf5810R，赛默飞）；透射电子显微镜（H-7650，HTACHI）；差式扫描量热仪（梅特勒托利多）；X-射线粉末衍射仪（SmartLab-9 kW，理学株式会社）；傅立叶红外光谱仪（Nicolet 20，赛默飞）。

　　主要实验材料：单硬脂酸甘油酯（L51111，西亚化学）；吐温-80（20200309，国药集团化学试剂）；肉豆蔻酸异丙酯（C10005751，上海麦克林）；油酸（k1929018，阿拉丁医药）；穿心莲内酯（JZ21101107，南京景竹生物）；硬脂酸（L28N10S104297，源叶生物）。

　　1.2 AG-NLCs的制备

　　将10 mg AG、100 mg肉豆蔻酸异丙酯、100 mg单硬脂酸甘油酯、2 mL无水乙醇于75℃水浴熔融作为油相；在30 mL蒸馏水中加0.5%吐温-80，75℃恒温水浴搅拌作为水相。将油相滴入水相中，保持75℃并搅拌乳化35 min，并将制得的初乳转移至300 W超声10 min，低温固化20 min后，即得AG-NLCs。NLCs同样用上述方法制备，但不加入AG。

　　1.3 HPLC法测定AG含量

　　精密称取AG对照品2.50 mg，置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声15 min，过0.22μm微孔滤膜，即得500μg/mL对照品储备液。色谱柱为安捷伦分析柱（Agilent5 TC-C18（2）250×4.6 mm），流动相为乙腈-水溶液（V:V=30∶70），流速为1.0 mL/min，检测波长为224 nm，柱温为25℃。

　　1.4包封率的检测

　　取所制AG-NLCs混悬液400μL至离心管中，3 000 r/min离心10 min，取上清液置于10 mL容量瓶内，乙腈定容至刻度，过0.22μm微孔滤膜后检测。记录峰面积，计算游离AG的含量，记为W1。另取400μL混悬液至5 mL容量瓶内，使用乙腈破乳后定容。同法检测，计算总AG含量，记为W2。按下述公式计算包封率：EE%=（W2-W1）/W2×100%。

　　1.5粒径的检测

　　取适量AG-NLCs加入马尔文粒度仪，测定其粒径和聚合度指数（Polydispersity Index，PDI）。

　　1.6 AG-NLCs的处方工艺优化

　　利用单因素试验对处方制备工艺的相关因素进行考察，包括固液脂质种类、表面活性剂种类、固液脂质比、药脂比、乳化时间和水浴温度，以筛选最佳水平，完成制备工艺优化。

　　1.7 AG-NLCs的表征

　　透射电镜法：将固化后的AG-NLCs样品用冷冻冻干机制备为干粉，分散在乙醇溶液中。同时，选择普通碳支持膜作为载网，使用滴管吸取分散液滴加至载网正面，待溶解挥干检测。

　　傅立叶红外光谱测试（FT-IR）：分别将AG、NLCs、AG-NLCs、AG+NLCs混合物使用冷冻冻干机除尽水分并干燥，各称量12 mg，并各自与200 mg的KBr研磨，置于磨具中，以适当压力在油压机上压成透明薄片后上样检测。

　　X射线衍射分析（XRD）包封情况：将待测样品研磨至粒径为48μm左右的粉末，其间不断过筛分离达标样品。研磨完毕后，将样品装载在显微镜载玻片上，滴加2滴乙醇，使粉末成薄浆状后均匀涂抹在载玻片上，待溶剂挥干后检查。

　　差示扫描量热分析（DSC）：参比物为铝空坩埚，氮气吹扫，扫描范围为30~300℃,分别对AG、NLCs、AG-NLCs、AG+NLCs物理混合物进行扫描。

　　2结果分析

　　2.1 AG-NLCs含量测定方法学的建立结果

　　2.1.1专属性试验

　　取配制好的AG-NLCs、NLCs和AG对照品溶液，根据前述条件进行测定，并记录色谱图（见图1）。AG的保留时间为13 min，而NLCs的HPLC图谱在4 min处有最高峰，表明在该方法下，NLCs与AG均有自己的特征峰且互不干扰。

　　2.1.2线性关系考察

　　取配制好的500μg/mL AG对照品溶液储备液，分别配制成5、10、25、50、100、200μg/mL的AG对照品溶液，进样测定并记录峰面积。以峰面积为纵坐标，以溶液质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，并得到回归方程Y=26.345X+34.553，R2=0.999 1。该结果表明，在5~200μg/mL的质量浓度范围内，峰面积与质量浓度呈线性正相关。

　　2.1.3检测限和定量限考察

　　按照2020版《中国药典》检测限（LOD）和定量限（LOQ）的测定方法，采用基于响应值标准偏差和标准曲线斜率法计算。按该公式计算得到：LOQ=10δ/S；LOD=3.3δ/S（注：δ为响应值的偏差，S为标准曲线的斜率）。δ为11.105，S为26.345，计算得到LOD为1.391μg/mL，LOQ为4.215μg/mL，符合药典要求。

　　2.1.4精密度考察

　　取同份AG对照品溶液，连续进样测定6次，记录峰面积。结果表明，AG峰面积的RSD值为0.24%，表明仪器精密度良好。

　　2.1.5加样回收率

　　取已知含量的AG-NLCs 9份，并精密加入已知含量的对照品溶液，按前述条件进行样品处理并进样测定，计算加样回收率。结果显示，AG的平均加样回收率为100.48%（n=9），表明该方法的准确度较高。

　　综上所述，所建立的AG-NLCs含量测定方法在一定质量浓度范围内测定精密度和准确度良好，可用于AG-NLCs中的AG测定。

　　2.2 AG-NLCs处方工艺优化结果

　　固-液脂质考察结果：选择单硬脂酸甘油酯、硬脂酸作为固体脂质；肉豆蔻酸异丙酯、油酸作为液体脂质。将上述四者进行两两搭配后制备AG-NLCs，并测试相关数据。结果显示，4种搭配方案下的包封率较好，均在80%以上。其中，以单硬脂酸甘油酯+肉豆蔻酸异丙酯进行搭配时较为理想，包封率为83.01%，粒径为140.5±1.747 nm，PDI为0.179±0.006。

　　表面活性剂考察结果：选择泊洛沙姆188、吐温-80和十二烷基磺酸钠为表面活性剂制备AG-NLCs，并测试相关数据。结果表明，吐温-80具有粒径小、分布均一，以及包封率高的优点。

　　固液脂质比值考察结果：固定其他因素，考察固液脂质比值分别为1:1、1:4、1:8、4:1、8:1时，对结果的影响。结果表明，在固液脂质比值为1:1时，粒径、PDI、包封率最佳。

　　药脂比值考察结果：考察药脂比值分别为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25时，对结果的影响。结果显示，药脂比值对包封率的影响较大，且没有显著正、负相关趋势，但各比例下纳米脂质载体的粒径均为200 nm左右，粒径均一程度较高，维持在0.2左右，且在药脂比值为1:20时，包封率最高。

　　搅拌时间考察结果：在一定时间范围内，乳化时间越短，所形成的脂质颗粒粒径越大，分布越不均一。结果显示，包封率与乳化搅拌时间存在较大关联性，且两者不呈线性相关。当时间为60 min时，包封率最大。

　　水浴温度考察结果：结果显示，温度的影响较为明显，粒径大小极值差异为316.1 nm，包封率差值为50.63%。在75℃下，粒径和PDI有最小值，且包封率达最高值。

　　综上，最佳制备工艺条件为：使用单硬脂酸甘油酯+肉豆蔻酸异丙酯作为固液搭配，将吐温-80作为活性剂，固液脂质比值为1:1、药脂比值为1:20，水浴75℃下搅拌60 min。

　　2.3 AG-NLCs结构表征结果

　　外形特征：通过透射电镜观察到，AG-NLCs外观圆整、颗粒分明，整体分布较为均一；其大小分布范围为150~200 nm。

　　粒径测定结果：测试结果发现，AG-NLCs平均粒径为164.7 nm，在电镜测试范围内；PDI平均值为0.169，表明其粒径分布范围较为均匀。

　　FT-IR表征结果：FT-IR测试结果显示（见图2A），在原料药AG的FTIR谱图中，1 647 cm-1出现羰基的特征吸收峰，2 700~3 100 cm-1范围内出现甲基、亚甲基及次甲基的伸缩振动；在AG-NLCs谱图中，原本代表AG的以上特征峰消失，猜想可能是由于AG的部分基团与脂质中的有关基团发生了相互作用，使得原本基团发生了偏移或消失，形成了AG-NLCs。

　　XRD表征结果：XRD测试结果显示（见图2B），在AG和物理混合物的XRD图谱中，衍射峰众多且相近，说明物理混合并未改变AG晶型状态，而制备成AG-NLCs后，晶体衍射效应消失，表明生成了无定型的AG+NLCs。

　　DSC表征结果：DSC测试结果显示（见图2C），AG原料药在235℃左右出现强吸热峰，而AG-NLCs在此处的吸收峰消失，且在160℃左右出现吸热峰，证明了AG-NLCs是一种不同于AG的新物相。

　　3讨论

　　本文采用熔融乳化-超声-低温固化法成功制备了AG-NLCs，并通过单因素法优化得到了最佳制备工艺：固液脂质分别为单硬脂酸甘油酯+肉豆蔻酸异丙酯，两者按1∶1比例搭配，将吐温-80作为活性剂，药脂比值为1∶20，乳化时间60 min，搅拌温度75℃。最终得到包封率较高的纳米脂质载体，制得的药物载体圆整均匀、类球形，粒径为160 nm左右，晶型和物相发生了改变。该方法为AG新剂型的制备和开发应用提供了参考，为提升AG的药用价值提供了实验基础。

参考文献

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