摘要：Th17细胞通常以微生物依赖的模式存在于肠道中，对维持肠道屏障的完整性和稳定性具有重要作用。当肠道菌群异常时，Th17细胞的数量会发生变化，进而引起肠道疾病和免疫失衡。文章通过使用混合抗生素饲养小鼠来构建菌群失调模型，并采用流式细胞仪分别检测实验组和对照组小鼠胸腺和脾脏中Th17细胞数量的占比。实验结果显示，混合抗生素喂养前期，实验组小鼠的体重明显下降，后期逐渐恢复。流式检测结果显示，实验组小鼠胸腺和脾脏的Th17细胞占比与对照组相比发生了显著下降，下降比率分别达到了47.70%和23.83%。研究结果表明，由混合抗生素饲养引起的小鼠肠道菌群失调，会导致小鼠胸腺和脾脏中Th17细胞数量的降低。

　　关键词：肠道菌群；Th17细胞；菌群失调；胸腺；脾脏

　　Th17细胞的概念于2005年被首次提出，其能够特异性高水平分泌IL-17[1]。Th17细胞主要参与宿主对多种感染的防御机制，尤其是对于宿主清除细胞外病原微生物的免疫反应[2]。肠道在充当微生物主要栖息场所的同时，还负责对入侵微生物进行免疫响应。此外，肠道菌群还可通过代谢产物、自身成分黏附于宿主细胞来保持肠上皮屏障的完整性，并塑造黏膜免疫系统，以平衡宿主的防御和免疫耐受性[3]。

　　Th17细胞通常以微生物依赖的模式存在于肠道中，对维持肠道屏障的完整性和稳定性具有重要作用。如果Th17细胞数目异常，就会引起肠道疾病和免疫失衡[4]。然而，肠道菌群异常对Th17细胞分化形成的作用机制尚不清楚。因此，本文拟通过菌群损耗构建肠道异常的小鼠模型，并通过检测肠道菌群损耗小鼠小肠组织的Th17细胞数量，明确正常小鼠肠道菌群失调对其主要免疫器官中Th17细胞数量的影响。

　　1.实验方法

　　1.1菌群失调模型构建

　　购买周龄为7周的C57BL/6小鼠10只，进入实验室后，按5只每笼进行分笼，并进行一周的小鼠适应性饲养。第8天开始，随机选择1组作为实验组；另一组作为对照组。实验组小鼠饮用普通自来水，并在自来水中添加复合抗生素。两组小鼠的饲料使用量相同。复合抗生素水的使用质量浓度为：氨苄青霉素1 g/L，硫酸新霉素1 g/L，甲硝哒唑1 g/L和万古霉素0.5 g/L。从饲喂抗生素开始，每2 d记录实验组和对照组小鼠的体重。混合抗生素饲养7 d后，对小鼠的胸腺和脾脏取样并进行流式检测。

　　1.2单细胞悬液制备

　　小鼠的胸腺和脾脏进行研磨过滤，500 g 4℃离心处理。使用溶血素重悬细胞，室温反应10 min。离心后使用RPMI 1640培养基对细胞进行重悬洗涤，并按照1∶10的比例进行稀释，对单细胞悬液进行计数，并调整细胞悬液浓度为1×107个/mL。

　　1.3荧光抗体标记

　　取5×106个淋巴细胞进行刺激，加入混合刺激液1X（2μL/mL），37℃培养4~6 h。500 g离心后使用5 mL染色缓冲液重悬细胞，并加入APC-CD4抗体1μL，涡旋混匀，室温避光反应20 min。反应结束后在每管样品中加2 mL细胞固定液，室温避光孵育20 min。600 g离心后使用2 mL细胞破膜液重悬，并加入PE-IL17A抗体1 uL，涡旋混匀，室温避光孵育30 min。离心后，加入300 uL染色缓冲液，涡旋混匀，使用流式细胞仪进行上机检测。

　　2实验结果

　　2.1菌群失调对小鼠生长的影响

　　实验结果显示，饲喂复合抗生素前，两组小鼠的体重较为接近，不存在显著性差异，而进行复合抗生素喂养的前3 d，实验组小鼠的体重出现了明显的下降，喂养4 d以后实验组小鼠的体重开始逐渐上升，且逐日增长，如图1所示。推测其原因，可能是实验组小鼠在刚开始饮用含有抗生素的水时，肠道菌群发生了变化，影响了小鼠的正常生长，而饲养后期，实验组小鼠适应了这种情况，体重开始慢慢增加。但是，直到实验结束，实验组小鼠的平均体重还是低于对照组小鼠。此外，两组小鼠排便情况正常，粪便呈均匀颗粒状，但是粪便颜色却有明显差异。经复合抗生素喂养的小鼠的粪便呈褐色，而对照组小鼠的粪便颜色则为黑色。两组小鼠的毛发光泽没有发生显著变化。实验结果表明，肠道菌群失调对小鼠的体重和粪便颜色产生了一定影响，但是对一些表观特征影响不明显。

　　2.2菌群失调对小鼠胸腺和脾脏Th17细胞的影响

　　分别取复合抗生素喂养一周小鼠的胸腺和脾脏，研磨制成单细胞悬液后使用CD4-APC和IL-17-PE对其进行荧光抗体染色，并使用流式细胞仪分别对胸腺和脾脏中的细胞进行荧光检测。流式结果显示，Th17细胞无论是在胸腺还是脾脏中，细胞数量都非常少，且胸腺中Th17细胞的数量占比不足0.5%，脾脏中不到0.2%，如图2-A、2-C所示，表明经复合抗生素喂养小鼠的胸腺和脾脏中Th17细胞的数量进一步减少了。实验组相比对照组，脾脏和胸腺中Th17细胞的数量分别降低了47.70%和28.33%。实验结果表明，使用混合抗生素饲养小鼠引起了小鼠肠道菌群失调的问题，导致了小鼠的主要免疫器官胸腺和脾脏中Th17细胞数目下降。

　　3结论

　　研究表明，肠道菌群失调易引起自身免疫性疾病及慢性炎症，同时对维持肠道屏障完整性和稳定性的Th17细胞数量影响也较大。此外，肠道菌群对宿主黏膜免疫系统的塑造至关重要，尤其是对维持肠道屏障完整性和稳定性的Th17细胞的分化形成。本文通过混合抗生素饲养小鼠来培育肠道菌群失调的小鼠，并采用流式细胞仪检测发现，菌群失调小鼠的胸腺和脾脏中Th17细胞的数量占比发生了较大变化，表明肠道菌群的稳态对宿主免疫细胞维持正常状态发挥着重要作用。然而，小鼠的肠道菌群影响脾脏和胸腺中免疫细胞数量的具体机制仍有待进一步探究。

　参考文献

　　［1］KORN T,BETTELLI E,OUKKA M,et al.IL-17 and Th17 Cells［J］.Annual Reviews of Immunology,2009,27:485-517.

　　［2］ONO M.Control of regulatory T-cell differentiation and　function by T-cell receptor signalling and Foxp3 transcription factor complexes［J］.Immunology,2020,160(1):24-37.

　　［3］BOUCH RJ,ZHANG J,MILLER BC,et al.Distinct inflammatory Th17 subsets emerge in autoimmunity and infection［J］.Journal of Experimental Medicine,2023,220(10):e20221911.