摘要：本文使用对黑色素瘤有靶向性的透明质酸，修饰氮化硼纳米材料，研究了靶向分子的表面修饰对于氮化硼靶向性能的影响。紫外和红外表征检测了修饰前后的特征峰变化，表明了靶向分子对氮化硼的成功修饰。以B16F10黑色素瘤细胞和L929正常细胞为研究对象，通过T/N测试考察修饰前后氮化硼的靶向性能。

　　关键词：氮化硼；透明质酸；表面修饰；黑色素瘤；靶向性

　　透明质酸（HA）是一种天然存在的带负电荷的线型多糖，广泛存在于细胞外基质中，主要由淋巴系统清除。HA具有一系列优异的性能，如生物相容性、生物可降解性和非免疫原性。据报道，HA受体的表达与肿瘤的发生有密切的关系。由于CD44受体在肿瘤细胞上可以高度表达，HA能够与CD44受体特异性结合，导致HA对肿瘤具有高亲和力。而正常细胞也表达CD44，但正常细胞的CD44受体表达能力不强，使HA对肿瘤细胞具有良好的选择性。

　　氮化硼（BN）纳米材料，也被称为白色石墨烯，具有类似石墨烯的蜂窝状结构，层内硼和氮原子交替形成sp2共价键，层间由弱范德华力结合。目前，由于氮化硼有着高机械强度、宽带隙、优异的导热性、高稳定性、良好的生物相容性和高细胞摄取能力而在生物医学领域上有着广泛的应用，如生物传感器、抗菌、骨组织工程、癌症诊断和硼中子捕获治疗等[2]。为了提高氮化硼对黑色素瘤的选择性，增强BN在癌症中的应用，我们用HA对BN进行表面修饰，探究表面修饰对纳米材料靶向性能的影响。

　　1实验部分

　　1.1实验试剂与仪器

　　氮化硼，阿拉丁；聚乙烯亚胺，PEI，阿拉丁；透明质酸，麦克林；硝酸，68%（质量分数），广州试剂厂；胎牛血清，FBS，BI公司；DMEM高糖培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）、胰酶和双抗（青-链霉素），Gibco公司。

　　电子天平，BSA224S-CW，赛多利斯仪器有限公司；恒温加热磁力搅拌器，DF-101S，巩义市予华仪器有限公司；超声波清洗器，KQ5200E，昆山市超声仪器有限公司；真空干燥烘箱，DZF-6020，上海索普仪器有限公司；离心机，H1850R，湘仪离心机仪器有限公司；冷冻干燥机，美国SP Scientific公司；微波消解仪MARS6，美国CEM公司；电感耦合等离子体原子发射光谱串联质谱仪，ICP-MSAgilent 8800，美国安捷伦科技公司；紫外可见分光光度计，UV-2700，日本岛津公司；红外光谱仪，Nicolet iS50R，美国赛默飞世尔科技公司；自动细胞计数仪，IC-1000，艾力特生命科学有限公司。

　　1.2细胞培养

　　B16F10小鼠黑色素瘤细胞和L929小鼠成纤维细胞，两种细胞株均来自武汉大学中国典型培养物保藏中心。细胞培养在37℃温度下和5%（体积分数）CO2环境中，使用高糖培养基进行培养，该培养基含有1%（体积分数）的双抗（青-链霉素）和10%（体积分数）的FBS，通过PBS和胰酶消化后用于传代培养。

　　1.3 BN表面改性

　　取30 mg BN和30 mL 10%PEI（聚乙烯亚胺）加入到100 mL烧杯中，在超声机中超声10 min以混合均匀，将烧杯放于磁力搅拌器下室温下搅拌2 h，搅拌完成后将混合物用50 mL离心管离心，在6 000 r/min的速度下离心30 min，然后用去离子水离心洗涤3次，最后在真空干燥箱70℃下干燥12 h，得到PEI预修饰的BN。

　　取20 mgPEI预修饰的BN和40 mL PBS加入到100 mL烧杯中，在超声机中超声10 min以混合均匀；再取800 mg HA加入到已经超声混合均匀的烧杯中，使用磁力搅拌器搅拌3 h；反应完后将混合物倒入50 mL离心管中，在6000 r/min下离心30 min，用PBS离心洗涤3次；离心完成后的固体在冷冻干燥机中冻干12 h，即可得到HA修饰的BN，标记为BN-HA。

　　1.4表征测试

　　紫外可见吸收光谱测试：将5 mg样品分散于5 mL去离子水中，在超声机中进行超声使其分散均匀，并用紫外可见分光光度计进行全波长测试（200~800 nm），确定其特征峰的位置。

　　傅里叶变换红外光谱测试：将样品放于烘箱中烘干后，取其中少量样品与干燥的溴化钾粉末混合，然后充分研磨，研磨后在模具中进行压片，得到均匀且透明的薄片。制片成功后通过红外光谱仪测试，即可得到样品的红外光谱图。

　　1.5生物性能测试

　　细胞摄取实验-T/N测试：将细胞以1.5×105个/孔的密度接种于6孔板中，培养24 h后，弃掉上清液后加入10μg/mL的样品继续孵育细胞24 h，弃掉上层培养基，加入PBS摇晃清洗细胞3次，收集细胞到离心管中，用自动细胞计数仪测量每组的细胞数量。再加入68%硝酸5 mL，在180℃下微波消解仪中处理30 min，消解完后用50 mL容量瓶定容，然后用电感耦合等离子体原子发射光谱串联质谱仪测量硼元素的浓度。T/N的计算公式如式（1）所示：

　　2结果与讨论

　　氮化硼纳米材料和HA在紫外中有明显的特征吸收峰，我们通过紫外可见分光光度计测试了未修饰的BN和经过HA修饰后的具体紫外吸收峰位置，从而判断HA是否成功修饰到BN上，结果如图1所示。HA在200 nm处有强吸收峰，与文献报道相符。BN材料则在206 nm处有明显的吸收峰。对比HA与BN-HA的吸收曲线，可以发现二者的特征吸收非常相似，BN-HA在200 nm处也有强吸收峰，说明HA应该已经成功负载于BN材料的表面。同时也发现BN材料自身在206 nm处的吸收峰已经消失，这可能是由于HA修饰于BN表面的掩蔽作用导致的。

　　图2-1是HA透明质酸、BN和BN-HA的红外全谱图，HA的特征振动已标注在谱图中。BN谱图中在790 cm-1和1 380 cm-1左右有两个特征吸收峰，可以分别归属为B-N-B键和B-N键的振动。经HA修饰后这两个特征吸收强度均有所降低，同样可能是由于HA修饰于BN表面的掩蔽作用所导致的，这也与紫外可见吸收光谱的结果相符合。图2-2中，对比未修饰的BN，BN-HA在1 675 cm-1和1 715 cm-1处有两个微弱的新的振动峰，这与HA上的红外特征峰相对应，从BN-HA上新键的引入可以推测HA已经修饰到BN上。紫外和红外的表征结果均可以说明HA已经成功负载于BN上。

　　为了测试HA修饰的氮化硼和未修饰的氮化硼的靶向性能的差异，我们测试了BN和BN-HA在B16F10黑色素瘤细胞和L929正常成纤维细胞中的硼元素摄取量，并计算出摄取比（T/N）值，从而评估HA修饰后对BN在癌细胞中的靶向性能影响，结果如图3所示。氮化硼的T/N值为0.93，对B16F10细胞和L929细胞几乎没有选择性；而经过HA修饰后，BN-HA的T/N值提高到了1.81，B16F10细胞摄取能力明显高于L929细胞。经过HA表面修饰得到的BN-HA，由于HA的靶向性，使得BN能够更容易地聚集到B16F10细胞中，从而提高了B16F10对其的摄取能力。通过T/N测试结果，证明了HA表面修饰的BN，可以提高BN对B16F10黑色素瘤细胞的靶向性能。这极大提升了BN在抗癌药物载体、硼中子捕获治疗和癌症诊断等生物医学领域的应用潜力。

　　3结论

　　通过PEI预处理BN，并与透明质酸进一步缩合，成功地制备出了透明质酸修饰的BN-HA。经过HA修饰之后BN-HA中的BN紫外可见吸收峰被HA所掩蔽，而且相对于未修饰BN，BN-HA出现了与HA相同的红外特征峰，紫外和红外表征证明了HA成功修饰到BN上。经过HA修饰后，BN在黑色素瘤中的T/N值从0.93提高到了1.81，显示出更好的靶向能力。本文只是对细胞摄取结果的分析，还需体内实验进一步验证。

       参考文献：

　　[1]Shi J,Ma R,Wang L,et al.The application of hyaluronic acid-deriva-tized carbon nanotubes in hematoporphyrin monomethyl ether-based photodynamic therapy for in vivo and in vitro cancer treatment[J].In-ternational Journal of Nanomedicine,2013(8):2361-2373.

　　[2]Zheng Z,Cox M,Li B.Surface modification of hexagonal boron nitride nanomaterials:a review[J].Journal of Materials Science,2018,53(1):66-99.

　　[3]Hou L,Yuan Y,Ren J,et al.In vitro and in vivo comparative study of the phototherapy anticancer activity of hyaluronic acid-modified sin-gle-walled carbon nanotubes,graphene oxide,and fullerene[J].Jour-nal of Nanoparticle Research,2017,19(8):286-303.