摘要：文章旨在通过网络药理学和分子对接技术，探索马蹬草治疗闭塞性脉管炎的潜在作用机制。文章通过查阅文献了解马蹬草的主要有效成分，从GeneCards、CTD和OMIM数据库中获取闭塞性脉管炎预测靶点，取马蹬草成分靶点与闭塞性脉管炎预测靶点的交集，得到马蹬草治疗闭塞性脉管炎症的潜在靶点，并在Cytoscape中构建“马蹬草成分-治疗闭塞性脉管炎-靶点”网络。同时，利用DAVID平台富集靶点功能，并借助Autodock和PyMOL软件对靶点及其对应的活性成分进行分子对接验证。结果显示，马蹬草治疗闭塞性脉管炎可能的主要有效成分有9个，且其对应的潜在靶点有31个；KEGG通路富集结果得到103条信号通路，主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、脂质与动脉粥样硬化、肿瘤坏死因子信号通路、HIF-1信号通路、中性粒细胞细胞外陷阱形成等。由此可知，马蹬草可能通过影响白细胞-细胞黏附、一氧化氮生物合成过程的正调控、血小板活化、细胞表面、质膜、细胞外间隙、酶结合、受体结合、肝素结合等生物学过程，以及调控多个靶点基因表达，来发挥治疗闭塞性脉管炎的作用，从而为验证马蹬草能够治疗闭塞性脉管炎提供科学的依据。

　　关键词：马镫草；闭塞性脉管炎；网络药理学；分子对接

　　血栓闭塞性脉管炎（Thromboangiitis obliterans,TAO）是一种以周围血管炎症和闭塞为特点的动静脉性炎性病变，主要累及四肢中小动静脉，可引起急、慢性血栓形成，导致患肢缺血坏死。目前，其发病机制尚未完全明晰，临床上多采用手术治疗，但经常复发蔓延，导致治疗成本高昂，病人致残、致死率较高。马蹬草（MD）还铁角蕨科植物过山蕨（Camptosorus sibiricus Rupr.）的干燥全草，具有活血化瘀、止血解毒的功效，是河南省大别山区、伏牛山区常用的民间用药，可用于治疗闭塞性脉管炎、下肢溃疡等疾病。马蹬草中含有三萜类、黄酮类、苯丙素、酚酸类等化学成分。抚顺铝厂职工医院、沈阳药学院等单位自1969年起便使用马蹬草来治疗血栓闭塞性脉管炎，并取得了很好的效果。虽然现有研究已经正式确定了马蹬草提取物可以扩张血管，对于治疗TAO具有积极意义，但其作用机制尚不明确。因此，本文拟采用网络药理学方法来系统地分析马蹬草治疗TAO的作用机制，并通过分子对接进行验证，以期为后续研究和开发应用奠定理论基础。

　　1资料与方法

　　1.1马蹬草主要有效成分收集

　　通过查阅文献，整理出马蹬草中的主要有效成分包括为山萘酚-3-葡萄糖-7-鼠李糖苷（kaempferol-3-glucoside-7-rhamnoside，MD1）、山萘酚（kaempferol，MD2）[4]、β-谷甾醇(β-sitosterol，MD3）、咖啡酸（caffeic ac山萘酚id，MD4）[4]、里白烯（diplotene，MD5）、白桦酸（betulinic acid，MD6）、3，5-二羟基苯甲酸（3，5-dihydroxybenzoic acid，MD7）、香豆酸（courmaric acid，MD8）、原儿茶酸（protocatechuic acid，MD9）、丁二酸（succinic acid，MD10）、香豆酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（trans-p-coumaric acid-4-O-β-Dglucopyranoside，MD11）、咖啡酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（caffeic acid-4-O-β-D-glucopyranoside，MD12）、腺苷（adenosine，MD13）、2，2'二硫化二苯并噻唑（Accelerator（DM），MD14）、尿嘧啶（uracil，MD15）、D-甘露醇（D-Mannitol，MD16）、卫矛醇（Dulcitol，MD17）、赤藻糖醇（Erythritol，MD18）、对羟基苯甲酸（4-hydroxybenzoic acid，MD19）、异香草酸（isovanillic acid，MD20）、肉桂酸（cinnamic acid，MD21）、棕榈酸（palmitic acid，MD22）。

　　1.2药物作用靶点筛选

　　使用Chemical Book（http://www.chemicalbook.com/）平台和960化工网（http://www.Chem960.com/），获得上述有效成分的“.mol”格式文件，并将各成分的“.mol”格式导入Open Bable GUI2.2.1软件中，生成标准的SMILES格式。同时，将SMILES文件导入Swiss Target Prediction在线靶点筛选平台，限定筛选潜在靶点的对应物种为“人”，并将选择可能性值大于0的靶点作为分析对象，得到作用靶点。

　　1.3 TAO疾病靶点的筛选

　　以“Thromboangiitis Obliterans”为关键词，搜索GeneCards（http://www.genecards org/）、DisGeNET（https://www.disgenet org/）、MalaCards（http://www.malacards.org/）和OMIM（https://www.omim.org/）数据库，找出TAO疾病的相关靶点。

　　1.4蛋白互作网络的构建

　　将药物的作用靶点和TAO疾病的靶点导入Venny平台，找出其共有基因靶点，并将所得的靶点上传到STRING数据库中，选择人类基因，设置信度为0.7，得到蛋白-蛋白互作数据。将蛋白互作数据导入Cytoscape 3.9.1软件，构建马蹬草-TAO（MD-TAO）蛋白互作网络，并利用Analyze network工具对网络进行分析完善。

　　1.5“成分-靶点-疾病”网络构建

　　利用Cytoscape 3.9.1软件，构建马蹬草“活性成分-靶点-TAO”网络图。

　　1.6生物功能通路富集分析

　　将马蹬草活性成分-TAO交集靶点导入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）平台，并提交基因信息，同时对靶点进行GO（gene ontology）富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes）通路富集分析，选择GO生物功能中的生物过程(biological process）、分子功能（molecular function）和细胞组成（cellular component）3个模块对基因进行功能注释。

　　1.7分子对接验证

　　利用RCSB PDB（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）数据库检索并下载关键靶蛋白的3D结构文件，并用AutoDock软件进行分子去水加氢处理。通过Pub Chem数据库下载活性化合物的3D结构文件。利用AutoDock Vina软件进行分子对接。

　　2结果分析

　　2.1马蹬草活性成分作用靶点筛选

　　将马蹬草中的22种活性成分导入Swiss Target Prediction在线靶点筛选平台中，共得到733个靶点，删去重复值后剩余335个靶点。利用Cytoscape 3.9.1软件构建网络，根据Degree大小对节点进行渲染，得到马蹬草活性成分-基因网络，如图1所示。

　　2.2马蹬草作用TAO的靶点筛选

　　将马蹬草活性成分作用靶点筛选出的335个靶点和TAO筛选得到的626个靶点导入Venny平台中，得到31个交集靶点，如图2所示。

　　2.3靶点蛋白相互作用分析

　　将上述交集靶点代入STRING网站中，得到马蹬草-TAO（MD-TAO）蛋白互作网络，如图3所示。

　　2.4马蹬草“成分-靶点-疾病”网络图

　　将马蹬草活性成分中与TAO共有的靶点筛选出来，导入Cytoscape 3.9.1软件，得到马蹬草-TAO“成分-靶点-疾病”网络，如图4所示。结果表明，马蹬草中所含有的22种活性成分均对TAO具有治疗作用，作用较为突出的有咖啡酸（caffeic acid，MD4）、山萘酚（kaempferol，MD2）、棕榈酸（palmitic acid，MD22）、腺苷（adenosine，MD13）、β-谷甾醇(β-sitosterol，MD3）、白桦酸（betulinic acid，MD6）、肉桂酸（cinnamic acid，MD21）、异香草酸（isovanillic acid，MD20）；相对集中的靶点有PTGS2（Cyclooxygenase-2环氧化酶2）、ESR1（Estrogen receptor alpha，雌激素受体α)、PPARG（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma，过氧化物酶体增殖物活化受体γ)。

　　2.5 GO生物功能过程和KEGG代谢通路富集分析结果

　　利用DAVID平台对马蹬草作用于TAO的GO生物功能进行分析，结果如图5所示。根据结果可知，马蹬草作用于TAO的靶点与生物过程（Biological Process）相关的条目最多，共有184条，主要涉及白细胞-细胞黏附、一氧化氮生物合成过程的正调控、血小板活化、白细胞介素-8产生的正调节、平滑肌细胞增殖的正调控、对脂多糖的反应、衰老、β-淀粉样蛋白的细胞反应、蛋白激酶B信号的正调节等。与细胞组成（Cell Component）相关的条目有28条，主要涉及细胞表面、质膜、细胞外间隙、质膜外侧、血小板α颗粒内腔、质膜整体成分、细胞外泌体、受体复合物、高分子复合物等。与分子功能（Molecular Function）相关的条目有50条，主要涉及酶结合、受体结合、肝素结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、配体激活序列特异性DNA结合、丝氨酸型内肽酶活性、胰岛素受体底物结合、蛋白激酶结合、脂多糖结合、整合素结合、蛋白质结合等。马蹬草作用TAO靶点的KEGG通路富集结果得到103条信号通路，选取其中排名前20的通道，如图6所示。其主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、脂质与动脉粥样硬化、肿瘤坏死因子信号通路、HIF-1信号通路、中性粒细胞外陷阱形成等通道。

　　2.6马蹬草活性成分与重要靶点分子对接验证

　　由KEGG代谢通路富集分析可知，马蹬草主要通过作用于GE-RAGE信号通路等来发挥对TAO的治疗效果。以GE-RAGE信号通路为代表进行分子对接验证，主要涉及的下游蛋白有：VCAM1、PIK3CA、TAT3、SERPINE1、AKT1、PIK3CB、SELE、F3、ICAM1。以分子对接活化能最小的成分为代表，各分子对接最低能量的热图如图7所示。

　　由图7可知，马镫草中的化学成分能够与治疗闭塞性脉管炎的分子通路的蛋白形成稳定的对接，且其中betulinic acid、cinnamic acid对接活化能最低。

　　3结语

　　通过网络药理学分析可知，目前马蹬草的22种已知成分中有9种与闭塞性脉管炎的治疗作用靶点密切相关。马蹬草活性成分与闭塞性脉管炎的治疗作用共有靶点有31个，从分子层面验证了马蹬草在治疗闭塞性脉管炎方面的有效性。马蹬草作用于闭塞性脉管炎的靶点与生物过程（Biological Process）相关的条目有184条，与细胞组成（Cell Component）相关的条目有28条，与分子功能（Molecular Function）相关的条目有50条，KEGG通路富集结果得到103条信号通路。研究显示，马蹬草可能通过影响白细胞-细胞黏附、一氧化氮生物合成过程的正调控、血小板活化、细胞表面、质膜、细胞外间隙、酶结合、受体结合、肝素结合等生物学过程，调控多个靶点基因表达来发挥治疗闭塞性脉管炎的作用。分子对接结果显示，马蹬草活性成分与闭塞性脉管炎的信号通路上的蛋白能够形成稳定的分子对接，进一步证实了马蹬草对闭塞性脉管炎治疗的有效性。

　　综上所述，马蹬草在治疗闭塞性脉管炎方面具有广阔的应用价值和开发潜力。

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