摘要：本研究建立了氟苯尼考药的液相色谱测定方法。通过研究色谱柱分离、定性波长、流动相选择等条件确定检测方法。并通过检出限、定量限、回收率和重复性实验评价方法。结果表明，选择TC-C18柱作为分离柱，最佳波长为223 nm，最佳流动相为25%乙腈水溶液，氟苯尼考线性达到0.999 75，检出限为0.05μg/mL，定量限为0.15μg/mL，添加量为0.5~3μg时回收率达到88.7%~100%，重复性RSD达到0.64%。此方法高效准确，能为氟苯尼考药主含量测定提供参考，也能为其他兽药氟苯尼考的测定提供思路。

　　关键词：高效液相色谱；氟苯尼考；原料药；主含量

　　氟苯尼考，又名氟甲砜霉素，是甲砜霉素的单氟衍生物，是动物新型广谱抗生素。氟苯尼考抗菌活性高、无潜在致再生障碍性贫血等优点，与氯霉素和甲砜霉素相比，在兽医临床上发挥着重要作用，已成为氯霉素禁用后的主要替代药[1-3]。目前国内应用的氟苯尼考制剂主要为可溶性粉、注射剂和预混剂等。不同制剂的应用目的各异，疗效也有一定差异，这就和每个产品的纯度相关，纯度越高，杂质少，疗效越好，作用发挥越彻底。

　　氟苯尼考难溶于水，检测不易，因此发展准确可靠地用于药品氟苯尼考药的含量测定的技术很有必要，确保动物性药品的安全，提高我国动物药品的质量。为了能快速直接对氟苯尼考含量进行定量及定性分析，本研究拟采用高效液相色谱法测定，研究选择最佳的提取溶剂，对样品直接溶解后上机测定，建立快速高效的前处理技术，最大限度的减少实验操作过程，减少样品损失，并通过对液相色谱仪检测条件进行优化，建立高效准确的检测方法。

　　1实验部分

　　1.1仪器及试剂

　　岛津液相色谱仪，配有DAD检测器；超声波振荡仪；涡旋仪。

　　标准品和试剂：氟苯尼考，1 000μg/mL，农业部环境环境保护科研监测所；乙腈Honeywell试剂，色谱纯；甲醇，Honeywell试剂，色谱纯；超纯水；氟苯尼考粉，市售。

　　1.2标准溶液制备

　　标准储备溶液制备（100μg/mL）：用移液管准确称取1 mL氟苯尼考标准品于10 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀，获得100μg/mL氟苯尼考标准储备溶液。

　　标准系列工作溶液：准确移取5、10、20、50、100、200、500μL标准储备溶液（100μg/mL）于7个10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀，配制成0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5μg/mL的标准系列溶液。

　　1.3样品前处理方法

　　称取约20 mg氟苯尼考原料样品于10 mL容量瓶中，用25%乙腈溶液溶解并定容至刻度，混匀，有机滤膜0.45μm过滤后，稀释100倍后供液相色谱分析。

　　1.4液相色谱条件

　　色谱柱：Agilent TC-C18 250 mm×4.6 mm，5μm；检测波长：223 nm；检测器：DAD检测器；柱温：40℃;流速：1.0 mL/min；进样量：20μL。流动相：25%乙腈；

　　1.5样品的测试

　　进样20μL，在上述色谱条件下，采用外标法定量，并通过保留时间定性。

　　2结果与讨论

　　2.1检测方法优化

　　2.1.1检测波长的选择

　　用DAD检测器对氟苯尼考标准溶液进行紫外光谱全波长扫描，全波长扫描发现210~245 nm有较强的吸收，其中最强峰210 nm和次强峰223 nm，选择次强峰223 nm作为检测波长，减少背景干扰。如图1所示。

　　2.1.2流动相的选择

　　考察了不同甲醇、乙腈试剂浓度对氟苯尼考分离的影响，实验设置了40%、60%、80%、100%甲醇体积分数和25%、50%、75%乙腈体积分数对氟苯尼考分离的影响，确定最佳的流动相浓度。研究发现，使用甲醇溶液作为流动相，氟苯尼考色谱峰出峰过快，达不到较好的分离度，使用乙腈溶液为流动相，分离度较好，其中25%的乙腈溶液为最佳。详见图2与图3所示。

　　2.1.3进样色谱柱的选择

　　由于氟苯尼考是弱极性化合物，色谱柱应选用非极性或者弱极性的固定相。本研究拟选用不同填料的非极性C18型反相色谱柱，其在适当条件下能实现较高的氟苯尼考分离度。选择TC-C18（250 mm×4.6 mm 5μm）和EclipsePlus-C18（150 mm×4.6 mm 3.5μm）两种C18型反相色谱柱进行实验，结果发现，TC-C18（250 mm×4.6 mm 5μm）作为色谱柱，氟苯尼考在TC-C18上的图谱峰形尖锐，无拖尾，无溶剂效应，分离度更好，因此选用TC-C18（250 mm×4.6 mm 5μm）作为色谱柱。

　　2.2方法适用性评价

　　2.2.1氟苯尼考线性范围

　　以0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5μg/mL氟苯尼考的标准工作溶液质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，作线性回归，得到线性方程为：y=44 983.4x-315.083，相关系数r=0.999 75。

　　2.2.2检测方法检出限和定量限

　　将氟苯尼考稀释到质量浓度为0.05μg/mL时，信噪比为3.13，可以作为检出限。当浓度为0.15μg/mL时，6次进样的RSD为1.51%，信噪比为10.05~10.80，满足定量限的信噪比要求。因此氟苯尼考检出限为0.05μg/mL，定量限为0.15μg/mL。

　　2.2.3重复性实验

　　本实验采用在空白溶液中加标的方法进行重复性实验，配制0.5μg/mL标准中间液作为样品溶液，统计峰面积，计算RSD。结果表明重复性实验RSD为0.64%。

　　2.2.4回收率实验

　　选择三水平加标，每种浓度3份平行样品方法制备供试溶液，进样，计算回收率，结果显示在0.5～3μg 3个添加水平下，氟苯尼考的回收率为88.7%～100%。

　　3结果分析

　　本研究建立了一种高效液相色谱法测定氟苯尼考药中的氟苯尼考主含量，通过对色谱柱、流动相、检测波长等检测条件进行优化，并对方法的检出限、定量限、重复性和回收率等进行验证，结果表明此方法可靠高效，可用于氟苯尼考药含量测定，建立了快速高效的前处理技术，最大限度地减少实验操作过程，减少样品损失，准确定量。

　　参考文献

　　[1]谢翠美，姚婉仪，胡浩光，等.氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考残留量的不确定度分析[J].食品安全导刊，2022（35）：79-83.

　　[2]罗兰，秦威振，王甫，等.液液萃取-液相色谱串联质谱法同时测定禽肉中的氯霉素、甲硝唑和氟苯尼考[J].职业卫生与病伤，2022，37（6）：364-371.

　　[3]竺杨彬，陈奕，锐凌飞，等.氟苯尼考及其中间体的合成研究进展[J].中国医药工业杂志，2023，54（4）：512-527.