【摘要】再生障碍性贫血（AA）是一种以全血细胞减少为特征的骨髓造血衰竭综合征，T细胞功能亢进、骨髓微环境异常是其发病的主要因素。微小分子RNA（miRNA）是一类保守的小分子非编码RNA，参与调控多种疾病的病理生理过程，在T细胞免疫和骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）成脂成骨分化方面具有重要调控作用。已有研究证实miRNA参与AA的发生发展，未来基于miRNA的靶向治疗可能成为治疗AA的方向。本文就miRNA在AA中对T细胞功能和BM-MSCs成脂成骨分化的作用进行综述。

　　【关键词】再生障碍性贫血；微小分子RNA；T细胞功能；骨髓微环境；间充质干细胞

　　Role and Research Progress of MicroRNA in Aplastic Anemia/GENG Xueyin,LI Buni,ZUO Huaqin,WANG Fangfang.//Chinese and Foreign Medical Research,2024,22(9):177-180

　　[Abstract]Aplastic anemia(AA)is a bone marrow hematopoietic failure syndrome characterized by pancytopenia.Hyperfunction of T cells and abnormal bone marrow microenvironment are the main factors of its pathogenesis.Micro RNA(miRNA)are conserved small non-coding RNA,which are involved in the regulation of pathophysiological processes of various diseases and play an important role in the regulation of T cell immunity and lipogenic osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells(BM-MSCs).It has been confirmed that miRNA participate in the occurrence and development of AA,and targeted therapy based on miRNA may become the direction of AA treatment in the future.In this review,the role of miRNA in T cell function and lipid osteogenic differentiation of BM-MSCs in AA was reviewed.

　　[Keywords]Aplastic anemia Micro RNA T cell function Bone marrow microenvironment Mesenchymal stem cells

　　First-author's address:Yangzhou School of Clinical Medicine of Dalian Medical University,Yangzhou 225001,China

　　再生障碍性贫血（AA）是一种少见且危及生命的骨髓衰竭性疾病，以全血细胞减少和骨髓造血细胞减少为特征[1]。AA在中国的年发病率约7.4‰，高于欧洲和北美[2-3]。T细胞功能亢进、骨髓微环境异常是AA发病的主要因素[4]。目前，其主要治疗措施是造血干细胞移植（HSCT）和强化免疫抑制治疗（IST）。然而，HSCT存在配型困难、费用高昂、移植物抗宿主病和其他治疗相关毒性等问题，IST存在血清病学反应及疾病复发、克隆演变的风险[5]。艾曲泊帕联合IST治疗AA取得了一定的血液学反应，但此方案也存在一定局限性[1，6]。

　　微小分子RNA（miRNA）是一类小分子非编码RNA，已被证实在多种人类疾病的发生发展过程中发挥着重要的调控基因表达的作用[7]。有证据表明miRNA在控制和调节免疫[8]及骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）成脂成骨分化方面具有重要作用[9]。在这篇综述中，重点关注miRNA在AA中对T细胞功能和BM-MSCs成脂成骨分化的调控作用。

　　1 miRNA的生物发生与功能

　　miRNA通常以独立的单顺反子或多顺反子位点存在，一些位于蛋白质编码基因的内含子中。激活信号驱动RNA聚合酶Ⅱ将miRNA转录成初级发夹RNA（pri-miRNA）。Pri-miRNA在细胞核中通过典型途径被加工成miRNA前体（pre-miRNA，通常长60~70个核苷酸），并通过输出蛋白5转运到细胞质中。细胞质中的pre-miRNA由RNaseⅢ酶Dicer进一步处理加工，产生miRNA双链。随后，miRNA双链与Argonaute 2相互作用产生功能性成熟miRNA[10]。

　　miRNA的“种子”序列与靶基因mRNA 3'非翻译区的互补序列结合，导致靶RNA的衰变或翻译抑制。miRNA除了通过Watson-Crick碱基配对原则和编码蛋白的靶mRNA结合外，还可以作用于其他非编码RNA，如环状RNA和超保守RNA。miRNA及它们的靶基因形成了一个巨大的监控网络，调节几乎所有生理病理过程[11]。因此，miRNA有可能成为许多疾病诊断和治疗的工具。

　　2 miRNA在AA发病机制中的作用

　　2.1 miRNA调控AA中T细胞活化和增殖

　　免疫功能障碍介导的造血干细胞（HSCs）破坏是AA的主要发病机制。已有证据表明AA患者体内存在严重的T细胞功能平衡失调，体内外研究已证实T细胞对AA骨髓细胞具有攻击作用。AA患者骨髓和外周血中活化的CD8+T细胞比例升高。从AA患者中分离的CD8+T细胞与体外共培养发现能抑制正常人CD34+细胞集落形成和促进细胞凋亡，提示AA患者CD8+T细胞功能障碍[4-6]。AA患者中CD4+T细胞数量和功能也存在异常，辅助性T细胞1（Th1）、辅助性T细胞2（Th2）和辅助性T细胞17（Th17）细胞增多[7]。调节性T细胞（Tregs）被认为可通过抑制自身反应性T细胞来控制自身免疫，在维持免疫平衡中发挥重要作用。几乎所有AA患者外周血中的CD4+CD25+FOXP3+Tregs数量均减少，Th17细胞数量与Tregs数量呈负相关[8-9]。AA中激活的T细胞产生大量促炎细胞因子如γ干扰素（IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α（TNF-α)等，这些细胞因子破坏HSPCs，导致外周血细胞减少[4]。另一方面，IST治疗AA的有效性亦为该病的免疫调节性质提供了令人信服的临床证据。

　　文献报道miRNA参与调控AA中T细胞活化和增殖，对免疫抑制治疗有反应的AA患者miRNA可恢复正常[12-14]。因此，越来越多的研究人员将注意力转移到基于miRNA的AA诊断和治疗反应评估方面。在最近的一项研究中，Lu等[15]整合了AA患者T细胞miRNA的表达谱，表明miR-34a-5p、miR-195-5p和miR-424-5p可能通过靶向组蛋白基因表达和组蛋白修饰来调节T细胞的分化。Hosokawa等[16]研究发现AA患者淋巴细胞亚群中miR-126-3p和miR-145-5p表达失控，通过增加靶基因MYC和磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基2（PIK3R2）的表达水平促进CD4+和CD8+T细胞的激活。免疫治疗成功后miR-126-3p和miR-145-5p表达水平恢复正常。同一研究组在41例AA患者的血浆中检测到上调的miR-150-5p和miR-146b-5p及下调的miR-1。IST治疗后miR-150-5p、miR-146b-5p和miR-1的表达均恢复正常，其中miR-150-5p下降最为明显[14]。AA中上调的miR-150-5p通过靶向Bach2促进重型再生障碍性贫血（SAA）T细胞激活。体外感染LV-miR150-5p至小鼠脾细胞，miR-150-5p受抑后Bach2表达显著上升，CD4+和CD8+T细胞增殖能力下降。利用SAA模型鼠，体内注射LV-miR150-5p后Bach2表达增加，T细胞活化减弱，IFN-γ水平下降。再次验证了SAA中miR150-5p与Bach2呈负相关，抑制miR-150-5p可降低T细胞的活化能力[17]。微阵列分析AA患者CD3+T细胞中miRNA的表达，结果显示16种miRNA上调和15种miRNA下调，其中miR-34a在AA中表达水平增高，抑制AA患者骨髓单个核细胞（BMMCs）中miR-34a表达后，其靶基因二酰基甘油酸激酶（DGK）ζ水平增加，T细胞活化标志物CD69和CD25表达降低，T细胞处于弱激活状态[18]。此外，有研究报道miR-23a靶向MEG3促进T细胞功能亢进、负性调控因子IFN-γ和TNF-α水平增加[19]。miR-335-5p通过靶向ADCY3调控AA中T细胞活化与增殖[20]。上调的miR-214靶向A20调控AA中T细胞的激活[21]。miRNA还参与调控AA中Th17/Treg比例失衡[22]。

　　2.2 miRNA调控AA中BM-MSCs成脂/成骨分化

　　众所周知，骨髓为造血提供了独特的微环境，骨髓MSCs在为造血提供的微环境中起着至关重要的作用。AA患者骨髓中细胞成分减少、脂肪增多，与骨髓微环境异常引起BM-MSCs向成脂分化增强有关[23]。已有研究表明miRNA对MSCs的成脂和成骨分化起调节作用，不同的miRNA控制脂肪细胞和成骨细胞分化之间的平衡[24-25]。在AA中，成脂和成骨平衡被打破，致使BM-MSCs成脂作用增强、成骨作用减弱。因此，抑制AA中BM-MSCs的成脂分化、促进BM-MSCs的成骨分化可能减缓疾病的发展。

　　过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ)是脂肪细胞形成的关键调节因子，可正向调节成脂，在BM-MSCs成脂分化中发挥重要作用，其受不同的miRNA调控。AA中上调的miR-146b-5p通过负性调控靶向泛素连接酶（SIAH2）抑制PPARγ的泛素化，促进BM-MSCs成脂分化。SIAH2是E3泛素酶之一，通过介导PPARγ泛素化下调PPARγ的表达，从而减弱BM-MSCs成脂分化能力。动物实验也证实，干扰miR-146b-5p可以改善AA模型鼠的症状[26]。miR-30a-5p通过靶向家族序列相似性基因13A（FAM13A）激活Wnt/β-catenin信号通路促进AA BM-MSCs成脂分化，PPARγ等成脂相关因子水平增加，脂滴增多[27]。AA中异常表达的miRNA调控PPARγ表达，反过来，PPARγ亦可调控miRNA的表达[28]。研究发现PPARγ在转录后水平调控miR-199a-5p的表达。PPARγ表达水平与AA中上调的miR-199a-5p呈正相关，与转化生长因子β诱导基因（TGFBI）呈负相关。转染leni-sh PPARγ至BM-MSCs进行成脂诱导，PPARγ水平下降的同时miR-199a-5p下调，对两个初级miR-199a表达没有影响，miR-199a-5p的靶基因TGFBI上调，BM-MSCs成脂能力减弱。再次过表达miR-199a可逆转leni-sh PPARγ转染引起的成脂分化抑制[28]。这些研究结果提示探索能通过抑制BM-MSCs的成脂分化来缓解AA的miRNA具有重要意义。

　　miRNA除了促进AA中BM-MSCs成脂外，还具有抑制成骨的作用。有证据表明miR-144-3p参与调节骨质疏松患者的骨稳态，以及可以抑制类固醇相关骨坏死患者的BM-MSCs的成骨分化[29-30]。Li等[26]研究发现AA患者BM-MSCs中miR-144-3p表达水平显著高于对照组，miR-144-3p缺失的AA BM-MSCs成骨分化能力增强，miR-144-3p过表达的AA BM-MSCs成骨分化能力减弱，成骨标志物碱性磷酸酶活性和骨钙素基因表达水平降低。在miR-144-3p过表达的AA BM-MSCs中，TET2水平降低，敲低miR-144-3p可上调BM-MSCs中TET2表达水平。沉默TET2后显著抑制BM-MSCs的成骨分化，而TET2过表达可逆转miR-144-3p介导的成骨抑制作用[26]。研究结果表明，TET2是AA患者BM-MSCs中miR-144-3p的功能靶点，miR-144-3p通过靶向TET2抑制AA患者BM-MSCs的成骨分化。

　　3 miRNA在AA临床中的作用

　　miRNA水平不仅反映AA疾病严重程度，还是判断治疗反应及预后的标记物。霍佳莉等[20]研究发现SAA患者外周血单个核细胞（PBMCs）中miR-335-5p表达水平显著低于（NSAA）患者。上调AA-PBMCs中miR-335-5p的表达可显著抑制CD4+和CD8+T细胞的活化，降低CD4+TNF-α+T细胞、CD8+IFN-γ+T细胞和CD8+TNF-α+T细胞比例。亦有研究报道SAA患者miRNA表达较NSAA患者显著升高[21，18]。高表达miR-126-5p的AA患者无进展生存期最短，IST治疗后有反应的AA患者miR-126-5p的表达显著降低[13-14]。miRNA作为生物标记物在鉴别AA和MDS方面可能发挥一定作用。AA和骨髓增生异常综合征（MDS）在病理生理和疾病进展方面具有相似之处，很难相互区分[31]，但两种疾病中存在差异性表达的miRNA[13]。Hosokawa等[14]对41例AA、24例MDS患者血浆样本中的miRNA进行验证分析，发现与MDS相比，AA中miR-1、miR-22-3p和miR-424-5p的表达显著下调。

　　鉴于miRNA在AA中的异常表达，基于miRNA的靶向治疗可能成为治疗AA的一种方法。有研究发现miR-146b-5p在正常人源性BM-MSCs中的过表达促进BM-MSCs的成脂分化。转染miR-146b-5p抑制剂的BM-MSCs不仅可逆转其成脂分化现象，而且使AA模型鼠的贫血症状及骨髓衰竭情况得到明显改善[26]。另一项研究显示抑制miR-150-5p表达水平可降低SAA患者外周血中T细胞的活化，延缓SAA模型鼠疾病进展[17]。

　　4小结与展望

　　综上所述，对调控T细胞功能和BM-MSCs成脂成骨分化的miRNA的深入研究可能会改变AA的状态并改善这种危及生命的临床症状。鉴定参与AA发病机制的miRNA将有助于开发新的AA诊断标志物和治疗靶点。然而，目前的研究仍局限于细胞实验及少数动物实验，缺少更多、更深入的体内功能研究来验证体外实验所观察到的结果。在患者体内控制miRNA水平是否真正可以成为减轻AA严重程度的一种方法仍是问题所在。总之，对AA发生发展过程中差异性表达的miRNA的相关研究为AA的诊断和治疗等方面提供了新的思路，未来基于miRNA的靶向治疗可能成为治疗AA的方向。

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