摘要： 基于乙醇提取法和正交试验分析组织培养和大棚培育2种种植方式下肇庆金线莲总黄酮提取工艺，比较不同生长周期下 金线莲总黄酮的含量变化。采用乙醇提取法，考察乙醇浓度、液料比和提取温度对不同种植方式金线莲总黄酮得率的影响。 随后通过正交试验进行分析最优的提取工艺，验证后使用此条件测定不同月龄金线莲总黄酮含量。金线莲总黄酮最优组合为料 液比1 :30 g/mL、水浴温度70 ℃、乙醇浓度80%，验证试验总黄酮得率为1.926%( RSD=1.11%，R2=0.992)。金线莲总黄酮含量 与月龄有关， 随着月龄的增加，2种种植方式的金线莲总黄酮含量逐渐上升，7月龄时达到最高值。优化的乙醇提取工艺可在不 同种植方式下的肇庆金线莲中稳定萃取总黄酮，并在7月龄时达到最大值，为金线莲活性成分分析和总黄酮质量评价提供参考。

　　关键词： 金线莲,黄酮,组织培养,大棚培育

　　0 引言

　　花叶开唇兰俗称金线莲，主产于福建、广西、广东 等地。金线莲味甘，性平，有养阴益肺、调和气血等功效，是中国传统名贵中药之一[1-4] 。金线莲富含多种活性 成分，主要包括多糖、黄酮、多酚和强心苷类等成分， 具有抗病毒、抑肿瘤和延缓衰老等生理活性。金线莲的成分含量可能因种植环境等因素而有所差异，其中黄酮类 物质是金线莲中主要的活性成分之一，是评估金线莲品 质的重要因素[5-6]。

　　采用硝酸铝显色技术，结合L9( 33 )正交试验设 计， 以金线莲为研究对象，探究乙醇浓度、料液比、水 浴温度对总黄酮类成分含量的影响，并筛选出最佳提取 条件。在此基础上，本研究对金线莲在不同种植方式下 的生长周期总黄酮成分进行了测定。经实验得到的数据系 统性和直观性强，可用于评估单一种植方式下金线莲的生 长周期，并可以比较2种种植方式的差异性，为金线莲产 业化提供科学数据的支持。研究结果可以帮助优化栽培技 术，提高金线莲的产量和品质，满足传统中药和功能性 食品工业的需求，为金线莲产业化提供科学数据支撑。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料

　　成品金线莲采自粤中西部资源植物种质保护与利用 实验室。

　　1.2 试验方法

　　1.2.1 检测波长的测定

　　精确称取0.5 g金线莲干燥粉末于具塞锥形瓶中， 加入15 mL 80%乙醇溶液，在60 ℃下水浴提取30 min ， 冷却过滤后，使用紫外可见分光光度计进行全波长扫 描。扫描结果表明，在505 nm处达到最大吸收，则选择 505 nm为检测波长。

　　1.2.2 标准曲线的制备

　　用芦丁标准品，以80%乙醇溶液作为溶剂。在505 nm 处测定吸光度值，平行重复试验3次，取平均值。根据 吸光度值与芦丁浓度之间的关系，构建芦丁标准曲线。

　　1.2.3 单因素试验分析金线莲总黄酮提取工艺

　　精确称取0.5 g金线莲干燥粉末，加20 mL不同乙醇 浓度( 50%～ 90%， 浓度梯度为10% )， 于恒温水浴锅 50 ℃浸提30 min，冷却过滤。接下来，取70%乙醇溶液 为提取液浓度，保持其他操作条件一致，通过对不同料 液比( 1 ∶20～ 1 ∶60 g/mL，料液比梯度为1 ∶ 10 g/mL) 以及不同水浴温度( 30 ～70 ℃,温度梯度为10 ℃)进行 测定，探究以上单因素对金线莲总黄酮提取率的影响。

　　此外，还需要分别取5 mL待测液，加0.5 mL 5%亚 硝酸钠溶液混匀后，静置6 min;并加入0.5 mL 10%硝酸 铝溶液， 混匀并静置6 min ; 随后， 加入5 mL 4%氢氧化 钠溶液，混匀并静置15 min。过滤后，在505 nm处测定 吸光度值，平行重复试验3次并取平均值。最后，根据 所测吸光度数据代入标曲公式，计算每个单因素影响下 的总黄酮提取得率。

　　1.2.4 正交试验

　　通过L9( 33 )正交设计，以总黄酮得率为指标，按 照设计的各因素条件进行试验，并使用SPSS软件进行数据采集和处理，确保试验结果的准确性和可靠性。

　　1.2.5 不同种植方式不同月龄总黄酮含量测定

　　选取一批生长情况相同且良好的金线莲无菌苗，接 种进MS+20 g蔗糖+0.5NAA+10%香蕉泥+10%土豆泥的 生根培养基中，进行生根培养。经过3个月的生根培养 后，将部分根系粗壮的金线莲植株移栽于大棚中进行土 培，剩余的金线莲无菌苗将继续进行组织培养。随后， 逐月分别采收60 g的组织培养或土壤种植的金线莲植 株，清洗干净后烘干待用。最后，分别将干燥的金线莲 研磨成细粉末，并按照最佳提取工艺条件在每月固定时 间进行测定，统计并比较金线莲不同种植方式和月龄的 总黄酮含量变化情况。

　　2 结果与分析

　　2.1 不同种植方式下金线莲植株的培育及芦丁标准曲线测定

       利用芦丁标准品溶液成功描绘出芦丁标准曲线，得到的回归方程为y=0.990 2x-0.002 8.其中R2为0.999 3.相 关性强，见图1.可用于计算各个样品中的黄酮得率。

　　2.2 金线莲黄酮的单因素工艺条件探索

　　通过醇提方式分析不同乙醇浓度、不同料液比和不 同温度对金线莲总黄酮得率的影响。结果表明，乙醇浓 度在50%～ 60%和70%～ 90%， 得率随着浓度的增加而 增大。在80%～ 90%会随着浓度的增大而趋平稳，见图 2A ;在料液比试验中，随着料液比提取溶剂的增加，金 线莲总黄酮的提取得率也相应下降，见图2B;在水浴温 度影响试验中，金线莲总黄酮提取得率在40 ～70 ℃呈现 上升趋势，见图2C。然而，在料液比为1 ∶20 g/mL时， 水浴后的提取液不足5 mL ，影响后续的试验;而且过高 的温度会导致黄酮成分失活，同时降低提取效率。在后 期的正交试验中，选择料液比为1 ∶30 、 1 ∶40 g/mL和 1 ∶50 g/mL，水浴温度为50 、60 ℃和70 ℃,以及乙醇 浓度为70% 、80%和90%进行分析。

　　2.3 正交试验结果及分析

　　试验以总黄酮得率为考察指标，根据表1的结果可 以看出， B项的极差最大， C项次之，得出料液比对总 黄酮得率影响最大，其次是水浴温度，乙醇浓度影响最 小。表2结果表明，料液比和水浴温度具显著影响，而 乙醇浓度则没有显著影响。综合极差分析和主体间效应检验分析的结果，提取金线莲总黄酮最优组合是料液比 1 :30 g/ mL，水浴温度70 ℃,乙醇浓度80%。

　　取金线莲粉末0.5 g，根据优化后的工艺条件进行提 取，并计算标准偏差。得到平均的总黄酮得率为1.926% ， RSD值为1.11%，则此条件能够有效提取19.26 mg/g的 金线莲总黄酮，稳定性较好。

　　2.4 组培苗不同月龄金线莲总黄酮含量变化

　　由图3可知，在组织培养下，金线莲生长过程中的 总黄酮含量在4 ～ 7月龄期间呈递增趋势，到7月龄时 达到最高值，总黄酮含量为15.757 mg/g。在不同月份 之间，总黄酮含量的增长率分别为13.42% 、49.02%和 7.26%。其中， 5—6月期间的总黄酮含量增长率最高， 5月和6月的总黄酮含量分别为9.858 mg/g和14.690 mg/g ， 两者之间的差异达到了显著水平(P<0.05 )。结果表 明，月龄对金线莲的总黄酮含量具有显著影响， 5—6月 是其生长过程中总黄酮含量增长最快的时期。

　　2.5 大棚养殖下不同月龄金线莲总黄酮含量变化

　　由图4可知，大棚养殖下金线莲在移栽过程中的总 黄酮含量表现出逐渐增加的趋势。移栽7月龄时，金线 莲的总黄酮含量达到最高峰，为19.723 mg/g。在不同 月龄之间，总黄酮含量的增长率分别为0.23% 、23.49% 和8.23%。其中， 5—6月期间，金线莲的总黄酮含量 增长率最高， 5月和6月的总黄酮含量分别为14.757 mg/g 和18.223 mg/g，两者之间的差异达到显著水平(P<0.05 )。 结果表明，月龄对金线莲的总黄酮含量具有明显影响， 而种植方式等因素也会对其含量产生影响。

　　3 小结与讨论

　　在药用植物研究中，评价金线莲药用价值的重要指 标是其总黄酮含量。根据肇庆金线莲提取工艺的结果发 现，料液比对总黄酮得率的影响最大，综合主体间效应检验，确定最佳组合为乙醇浓度80%，料液比1 :30.水 浴温度70 ℃;肇庆金线莲黄酮的最佳提取工艺与漳州南 靖( 88%乙醇浓度、 1 :40 g/mL的料液比和超声提取时 间80 min )[1] 、贵州兴义( 85%乙醇浓度、 1 :50 g/mL料 液比和90 ℃水浴温度) [2]和福建厦门( 80%乙醇浓度、 1 :30 g/mL液料比和45 ℃水浴温度) [4]结果有所差异。 这表明不同品种间金线莲黄酮的提取工艺不尽相同。

　　进一步研究发现，不同品种的金线莲总黄酮成分同 样存在差异。滇越金线莲总黄酮总量显著高于2个福建 品种[7] ，广东省金线莲品种总黄酮含量( 19.26 mg/g) 远高于广西的金线莲品种( 3.80 mg/g) [6] 。此外，种植 方式也会影响金线莲总黄酮的含量。吴岩斌等[8]研究发 现野生型金线莲总黄酮含量( 11.57 mg/g)会高于组培 来源的金线莲( 9.35 mg/g);薛梅花等[9]将组织培养5个 月的金线莲移栽到林下种植6个月后发现，土壤种植的 金线莲五种黄酮类化合物的总含量( 2.335 mg/g)接近 组织培养金线莲的4倍( 0.706 mg/g);邹金美等[10]将福 建本地金线莲组培生根后移栽3月龄以上检测到的总黄 酮含量( 0.644 mg/g·DW)含量显著高于(P<0.05 )组 织培养的金线莲( 0.277 mg/g·DW) 。在本研究评价组 培和土壤种植肇庆金线莲的药用价值时也得到一致的结 果，土壤种植的金线莲总黄酮的含量( 19.723 mg/g)较 组织培养( 15.757 mg/g)的高。值得注意的是，在其他 种源的金线莲研究中却有截然不同的结果。台湾种源组 织培养的金线莲总黄酮含量( 7.62 mg/g)会比野生种植 的台湾种源( 6.06 mg/g)、云南种源( 7.09 mg/g)和广 西种源( 5.34 mg/g)的要高[11] 。不同来源的金线莲总黄 酮含量不同，选取的种植方式也应该不同。

　　我国的金线莲主要种植于福建、广东、广西、台湾 等地，肇庆地区腐殖质土层较厚，有机质含量高，非常 适宜金线莲生长。而黄酮是金线莲的主要活性成分， 总黄酮含量对金线莲的药用价值有着很大的影响[12] 。本 研究发现，不同种植方式下肇庆金线莲黄酮的含量有所 不同，土壤种植与组织培养下肇庆金线莲总黄酮的含量 变化有较大差异，其含量随月龄增长都有着显著的变 化。金线莲组培苗在5—6月的总黄酮增长率最高，达到 49.02% ， 6月龄的总黄酮含量为14.690 mg/g，整个组培 阶段， 其总黄酮增长率为81.29%; 土培苗在5—6月的 总黄酮增长率最高，为23.49%，移栽6月龄的总黄酮含 量为18.223 mg/g，整个土培阶段，其总黄酮增长率为 33.95%。因此，金线莲中总黄酮含量受不同种植方式的 总体影响较大，经移栽土壤种植的金线莲总黄酮含量明 显高于组培金线莲。可见金线莲随着月龄的增加，植株 活性成分处于累积状态，总黄酮含量缓慢增长[13] 。广西金 线莲同样也是6月龄的总黄酮含量最高(3.80 mg/g)[6] ;漳 州南靖和莆田仙游的土壤种植金线莲则是5月龄总黄酮含量最高，不同部位的金线莲总黄酮含量均达到20 mg/g以 上[1] 。虽然土壤种植为金线莲黄酮累积创造有利条件， 但是金线莲大棚土壤种植后期存在病虫害、野生动物啃 噬、降雨所带来的烂根现象的问题，导致植株缺失严 重。移栽后期对金线莲的日常管理需消耗更多的成本， 综合试验结果，认为肇庆金线莲的采收时间在移栽期 为6月龄时较为适宜。对于金线莲移栽种植，仍需从选 址、优化移栽环境与条件等方面着手，科学应用优质栽 培技术，以期提高金线莲移栽种植质量和产量[9] 。本文 主要为肇庆金线莲总黄酮的研究提供基础数据，有助于 该地区金线莲资源的产业化发展和地方标准的制定。

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