摘要：文章旨在评估新开发的心肌肌钙蛋白T（cTnT）检测试剂性能，包括准确性、灵敏度、精密度、特异性、抗干扰能力、线性范围和参考区间，并与市售产品比较，评估其在临床早期诊断心肌损伤中的应用价值。结果表明，试剂的回收率在85%～115%，检测限为10 pg/mL，变异系数≤15%；在高浓度下对其他肌钙蛋白和干扰物质无非特异性反应；线性范围为15～10 000 pg/mL；临床样本检测结果与市售试剂无显著差异，显示高度一致性。

　　关键词：检测试剂盒；性能评价；临床研究

　　肌钙蛋白T（cTnT，分子量39.7 kDa）是调节横纹肌收缩的一种物质。具体包括3种亚型：骨骼肌肌钙蛋白T（sTnT）的快骨骼肌型和慢骨骼肌型，以及心肌型。多数心肌cTnT以复合物形式存在，少部分以游离形式活跃于心肌细胞质中。因cTnT与sTnT的基因编码不同，骨骼肌中无cTnT的表达。心肌cTnT是心肌损伤的特异性和高敏感性标志物[1]。当心肌细胞损伤时，心肌cTnT会在血清中释放3～4 h并持续2周左右[2-3]。因此，心肌cTnT浓度的变化，对于诊断心肌损伤的严重程度具有重要价值。

　　目前，cTnT检测方法包括化学发光法、荧光免疫层析法和酶联免疫法。其中，化学发光法以高准确性、灵敏度和精密度著称，但需冷藏以保护试剂性能。本研究开发的干式磁微粒化学发光试剂，能在保持原有优势的基础上，实现常温运输和保存。

　　1材料与方法

　　1.1材料与仪器

　　材料：抗体cTnT-clon1和cTnT-clon2，购自生一（厦门）生物科技有限公司；磁性微球，购自恩碧乐（深圳）生物科技有限公司；吖啶酯，购自深圳市美凯特科技有限公司；化学试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。

　　仪器：全自动化学发光测定仪（ADL-1000），购自安邦（新疆）生物科技有限公司；自动滴珠机（LC200-R），购自厦门武门自动化科技有限公司。

　　1.2液体配制

　　储存液配制。含5%甘露醇、0.01%吐温20、0.1%Proclin300、2%牛血清白蛋白（BSA）和10%蔗糖的50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.2）。

　　激发液配制。预激发液：含0.1%H2O2的HNO3溶液（0.1 mol/L）；激发液：含1%TritonX-100的NaOH溶液（0.2 mol/L）。

　　试剂复溶液配制。含0.1%Proclin300的PH 7.4磷酸盐缓冲液（PBS）。

　　1.3包被微球溶液制备

　　将10 mg羧基磁性微球加入样品管，依次添加900μL pH 5.0的2-吗啉代乙磺酸（MES）溶液、100μL 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（EDC）溶液和200μL N-羟基丁二酰亚胺（NHS）溶液，室温反应30 min。去除上清液，加入1 mL MES溶液和100μg cTnT-clon1，在37℃下孵育3 h。磁分离并去除上清，加入50μL牛血清白蛋白溶液封闭1.5 h，用含吐温20的Tris缓冲生理盐水（TBS缓冲液）洗涤4次，得到包被微球溶液。

　　1.4标记抗体制备

　　将cTnT-clon2抗体与15倍摩尔量的吖啶酯混合，在25℃避光条件下反应2 h，再加入20倍摩尔量的赖氨酸，避光反应1 h。将标记后的复合物透析24 h（pH 7.4的PBS），用试剂储存液将抗体浓度稀释至0.001 mg/mL，制得标记抗体溶液。

　　1.5微球冻干

　　分别将包被微球溶液和标记抗体溶液加入自动滴珠机，点样量20μL/滴。将得到的微球转入真空冻干机冷冻干燥，分装至样品杯得到冻干微球试剂。

　　1.6检测方法

　　分别将20μL待测样本、125μL试剂复溶液加入冻干微球试剂，在37℃下温育10 min，清洗3次；加入预激发液和激发液各100μL，采用全自动化学发光仪器检测浓度。

　　2检测试剂的性能分析结果

　　2.1准确性

　　分别将浓度为25.79，506.45，2 158.96 pg/mL的样本和10 000 pg/mL的cTnT准确性参考品按照9∶1的比例混合。每个样本检测3次并计算回收率，结果分别为99.02%，96.24%和95.05%。

　　2.2检出限LOD

　　检测空白样本（含1%BSA的10 mM PBS溶液），每天2次，连续10 d，共测定20次。结果为正态分布=4.058，标准偏差（SD）=0.514，检出限LOD=4.904 pg/mL。

　　选取5个低浓度样本，用试剂进行重复检测，每天检测5次，连续3 d，计算LOD结果，如表1所示。

　　对检测结果进行正态性检验，P=0.004<0.05，表明不呈正态分布。按非参数方法估计LOD，结果为9.831 5 pg/mL。因此，取10 pg/mL作为心肌cTnT测定试剂的检出限。

　　2.3精密度

　　取心肌cTnT测定试剂，连续20 d检测浓度为25，100和1 000 pg/mL的参考品，并进行精密度分析。3个浓度参考品结果的变异系数分别为6.53%，5.36%和4.83%。

　　2.4特异性

　　cTnT、心肌肌钙蛋白C（cTnC）、sTnI分别用参考品稀释液稀释成浓度为1 000 ng/mL的特异性样本。每个样本平行用试剂检测3次。结果表明，cTnT检测结果均<10 pg/mL，未出现非特异反应现象。

　　2.5干扰试验

　　按照1 mL样本+0.1 mL PBS溶液（10 mM pH 7.0，含1%BSA）的方式制得3种浓度的对照样本；按照1 mL样本+0.1 mL干扰物溶液的方式制得各浓度对应的干扰样本。用试剂分别检测对照样本和干扰样本，计算两者的相对标准偏差（SRSD），如表2所示。

　　结果表明，干扰物在实验浓度条件下，未影响样本检测结果。

　　2.6线性范围

　　用cTnT抗原配制系列浓度样本，每个样本测试3次，建立标准曲线方程。用方程计算样本浓度测定值，以理论浓度（xn）为自变量，以测定值均值（yn）为因变量进行线性回归，绘制剂量反应曲线，确定线性范围。试剂线性方程y=10 038.322x+16.204，R2=0.999 9。因此，心肌cTnT测定试剂的线性范围为15～10 000 pg/mL。

　　2.7参考区间

　　检测163例健康人群样本，男女分别为79例和84例。心肌cTnT试剂检测结果显示，数据呈非正态分布（P<0.05）。采用非参数统计方法，参考值估算上限为25.08 pg/mL，确定cTnT参考区间<25 pg/mL。

　　2.8临床性能验证

　　采用罗氏诊断公司的高敏肌钙蛋白T检测试剂盒进行同步盲法检测110例临床样本，通过回归分析和Bland-Altman一致性分析，考察考核试剂的临床应用性能与已上市产品的等效性。

　　分析偏差图显示，考核试剂与参比试剂结果存在差异，需采用Passing-Bablok回归模型拟合。模型得出回归方程y=0.225 9+1.010 9x，斜率b为1.010 9（95%置信区间为0.961 7～1.021 9），截距a为0.225 9（95%置信区间为-0.251 2～1.410 6），表明2种方法无系统性差异。

　　对纳入统计的110例样本的检测结果展开数据分析，以考核试剂和参比试剂的检测结果的差值百分比作为Y轴，以两者均值作为X轴，绘制Bland-Altman图，计算一致性界限LOA及其95%置信区间（见图1）。

　　结果显示，考核试剂与参比试剂检测结果的LOA下限和LOA上限均在国家卫生部室间质评标准要求的可接受范围内，说明考核试剂和参比试剂具有较好的一致性。

　　3讨论

　　cTnT、肌钙蛋白I（cTnI）、CK-MB（肌酸激酶的一种同工酶形式，来源于心肌）作为急性心肌梗死的标志物均有助于早期确诊，诊断价值从高到低依次为cTnT、cTnI、CK-MB[4]。本文建立了基于干式磁微粒化学发光技术的cTnT检测方法，并对其试剂性能进行了研究。110例临床样本的检测结果显示，该方法与对比试剂结果无显著差异，且一致性高。

参考文献

　　［1］陈效琴.三种心肌肌钙蛋白的检测方法比较及其应用研究［J］.吉林医学,2011,32(24):4994-4995.

　　［2］KATUS H A,REMPPIS A,LOOSER S,et al.Enzyme linked immunoassay of cardiac troponin T for the detection of acute myocardial infarction in patients［J］.Journal of Molecular and Cellular Cardiology,1989,21(12):1349-1353.

　　［3］CHRISTOPH L,HELGE M,HOLGER N,et al.Release kinetics of cardiac biomarkers in patients undergoing transcoronary ablation of septal hypertrophy［J］.Clinical Chemistry,2012,58(6):1049-1054.

　　［4］翟英超.血清cTnT、cTnI及CK-MB水平对急性心肌梗死的诊断价值［J］.中国卫生工程学,2021,971-972.