摘要：文章围绕深色雪茄发酵过程中多酚氧化酶与美拉德反应的协同作用展开探讨，旨在阐明两者对雪茄色泽、香气及品质形成的调控机制，优化烟叶色泽和香气品质。实验结合美拉德反应的关键条件（氨基酸和糖），设计单因素实验优化发酵工艺。结果表明，在发酵温度37℃、湿度35%、菌液接种量1%、赖氨酸0.1 g/100 mL、葡萄糖0.1 g/100 mL、pH 7条件下，烟叶总色差值(ΔE）较对照组提高6倍，烟叶色度加深，香气总量增加55%，对烟叶香气具有明显提升。研究结果为深色雪茄的工艺改进提供了依据，通过调控酶促与非酶褐变的平衡，实现了烟叶感官品质的协同提升，为深色雪茄的生产提供了参考。

　　关键词：多酚氧化酶；美拉德反应；雪茄烟叶发酵；色度；气质分析

　　在高端雪茄领域，马杜罗雪茄凭借独特的深褐色至黑褐色茄衣，为品鉴者带来浓郁的感官体验[1]。其优质的色度参数和油性表现，成为衡量高端雪茄品质的重要指标。当前，国内雪茄产业虽在发酵技术上取得一定进展，但普遍存在烟叶色泽浅、油性不足的问题，使得国产茄衣难以达到马杜罗标准要求的理想色度，制约了国产高端雪茄的发展[2-3]。

　　自然发酵是烟叶处理的常用方法——将调制后的烟叶置于自然环境中，经历温和的发酵过程，使烟叶内部发生氧化转化等一系列化学反应[4]。仓储环境中的温度和湿度变化促使烟叶内大分子物质逐步降解（通常需要1～3年）。经处理后，烟叶在外观和内在品质上均发生显著变化[5-6]：在外观上，烟叶色泽变深且更均匀，含水率趋于稳定；在内在品质上，香气物质富集，口感得到改善，杂气和刺激性降低，燃烧性能提升。然而，自然发酵存在明显局限性：过长发酵周期难以满足工业化生产需求；大量仓储空间被占用；对环境温湿度依赖度极高，潮湿环境下极易发生霉变[7]。相关研究[8]表明，烟叶需经过1～1.5年贮存才能有效醇化，改善香气，且在仓储过程中必须严格控制温度、湿度和氧气浓度等参数，以防止霉变发生。

　　马杜罗雪茄茄衣具有浓郁的色泽与风味，本质上源于烟叶发酵过程中酶促与非酶促褐变反应的共同作用。植物源多酚氧化酶（PPO）广泛参与酶促褐变——其作用底物多酚类物质不仅能增强烟叶抗紫外和抗虫能力，还对雪茄的香气强度和感官特性有重要调控作用[9-11]。在多酚氧化酶家族中，儿茶酚氧化酶主导植物组织褐变，而微生物代谢主要依靠漆酶与酪氨酸酶[12-13]。同时，非酶促的美拉德反应通过还原糖与氨基酸的缩合聚合，不可逆地生成深色类黑精色素[14]。这正是马杜罗茄衣呈现标志性深褐色的化学原因。在美拉德反应中，不同种类的氨基酸还会衍生吡嗪、呋喃等关键致香物质，形成雪茄复杂的风味体系[15]。因此，深入探究多酚氧化酶与美拉德反应在马杜罗烟叶发酵中的动态交互机制，是解开其色泽形成和风味调控奥秘的关键所在。

　　本实验旨在通过特异性筛选获得能够生产多酚氧化酶的菌株，并将其应用于雪茄烟叶发酵，通过协同利用多酚氧化酶的酶促褐变和美拉德反应的非酶促褐变机制，优化雪茄烟叶发酵工艺。具体筛选适宜的赖氨酸、葡萄糖浓度及pH，结合产多酚氧化酶菌株，增强发酵液的褐变能力，提升发酵效果，实现加深烟叶颜色的目标，为解决国产雪茄茄衣色度不足问题提供新的思路和方法。

　　1材料与方法

　　1.1材料与试剂

　　雪茄烟叶来自湖北恩施州晾制结束的CX-26雪茄茄衣。菌株为湖北工业大学功能酵母与酿造微生物实验室分离筛选的产多酚氧化酶菌。主要试剂：琼脂粉（AR），购自上海源叶生物科技有限公司；酵母粉（AR），购自安琪酵母股份有限公司；氯化钠、蛋白胨、葡萄糖（AR），购自国药集团化学试剂有限公司；L-赖氨酸（AR），购自江苏九洲药业有限公司。

　　1.2仪器与设备

　　电子分析天平，购自北京赛多利斯天平有限公司；高压灭菌锅，购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；UV-722型紫外可见分光光度计，购自上海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂；HNY-211B恒温培养振荡器，购自天津欧诺仪器仪表有限公司；SPX-150D型恒温生化培养箱，购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；CJ-2D型无菌操作台，购自天津市泰斯特仪器有限公司；PE-28 pH计，购自梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司；恒温恒湿箱，购自天津欧诺仪器仪表有限公司；旋转蒸发仪，购自上海亚荣生化仪器厂；气相色谱-质谱联用，购自安捷伦科技有限公司。

　　1.3试验方法

　　1.3.1菌种的筛选与鉴定

　　参照潘勇等[16]方法并适当改良。具体操作流程如下：称取2 g烟叶样品，加入100 mL的LB培养基，置于37℃恒温摇床中，以220 r/min转速进行培养。48 h后，对培养物进行梯度稀释，均匀涂抹在绿原酸鉴别培养基表面，继续培养48 h后筛选出典型菌落。LB培养基经划线分离法得到纯培养物，挑选3个纯培养菌株进行活化培养，并与50%的甘油溶液按照等体积比例混合，分装至已灭菌的离心管中。每个菌株设置3个生物学重复组，于-80℃超低温环境中保存，保证菌种纯度，为后续实验研究打下基础。

　　1.3.2 PPO酶活性测定

　　将菌株接种到发酵培养基，37℃、220 r/min条件下发酵72 h。将发酵液于4℃、7 000 r/min下离心，上清液即粗酶液。反应体系：将0.1 mol/L pH 6.0的磷酸盐缓冲液3 mL、1 mL浓度为0.1 mol/L邻苯二酚溶液和0.2 mL粗酶液混合均匀，于37℃反应30 min后测定OD460。以0 min时的反应体系作为空白对照。参照潘勇等[16]方法，酶活性计算公式如式（1）。

　　发酵后，L*升高，表明烟叶颜色变浅、亮度增加；a*升高（红色增强），可能反映多酚类物质氧化（如美拉德反应），导致烟叶呈现红棕色；b*升高（黄色增强），可能与类胡萝卜素等色素的变化有关，或褐变产物的积累。ΔE表示2个颜色间的总体差异，数值越大，表明所测样品颜色越深。因此，可通过发酵前后ΔE值的变化反映烟叶发酵前后色度的变化[17]。

　　1.3.5挥发性香气物质检测方法

　　本研究采用蒸馏萃取结合气相色谱-质谱联用测定发酵后雪茄烟叶的挥发性致香成分[18]。将发酵前后的烟叶样品置于75℃环境下，烘干处理后粉碎，过40目筛子。精确称取10 g经处理的烟叶样品，加入1 000 mL圆底烧瓶，混合200 mL饱和氯化钠溶液，作为水相；取100 mL圆底烧瓶，加入60 mL二氯甲烷，作为有机相。将两相分别连接到SDE装置两侧，有机相采用50℃恒温水浴加热，水相则使用150℃油浴加热，持续反应5 h，直至装置中形成稳定的液液分层，完成萃取。收集萃取液，加入50μL浓度为1.202 8 mg/mL的乙酸苯乙酯内标溶液，经旋转蒸发仪浓缩至2 mL，再由无水硫酸钠脱水干燥处理，用0.22μm有机相微孔滤膜过滤，将得到的样品转移到Agilent进样瓶，采用气相色谱-质谱联用技术进行成分分析。

　　实验使用Agilent Techologies 7890A气相色谱仪和5975C质谱仪联用的系统开展分析工作，采用HP-5MS毛细管柱进行色谱分离，进样量1μL，载气为氦气，流速1 mL/min，分流比10∶1。色谱条件设置：进样口温度250℃,采用程序升温，初始温度40℃,维持2 min，后以2℃/min速率升温到200℃,保持5 min，再以10℃/min速率升温到280℃。传输线温度为250℃,离子源的温度为230℃,采用70 eV电子轰击电离模式。本研究借助安捷伦科技NIST14.0质谱数据库的检索功能，对气相色谱-质谱联用分析得到的色谱峰的质谱图开展系统比对工作。过程中，以谱图相似度为主要鉴定依据，从中挑选出匹配度最高的结果，作为定性标准，实现对挥发性香气成分的准确鉴定。

　　1.4美拉德产物荧光分析

　　在100 mL无菌水中加入10 g烟丝，制备烟叶培养基，灭菌备用。将培养基pH调至7.0，分别添加以下单一成分（质量浓度均为0.1 g/100 mL）。

　　（1）氨基酸组：谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸。

　　（2）糖类组：葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉。

　　于37℃恒温摇床中培养24 h，测定各反应产物在激发波长350 nm、发射波长430 nm下的荧光强度，评估美拉德反应强弱[19]。

　　1.5发酵液制备与应用

　　初始烟叶发酵条件：37℃、烟叶回潮湿度25%、发酵7 d。基于多酚氧化酶和美拉德反应2个因素，调整烟叶发酵的理化特性和发酵条件，探索更优的烟叶发酵机制。以400 g烟叶为一组，称取多组，回潮至湿度25%，备用。

　　1.5.1多酚氧化酶对烟叶发酵的影响

　　接种1%产多酚氧化酶菌株（按烟叶干重计算，下同），加入无菌水制成接种液，均匀喷洒在烟叶上，使最终含水率为35%。对照为未加微生物处理，其余处理均与实验组相同。

　　1.5.2美拉德反应对烟叶发酵的影响

　　参照苏加坤等[20]方法并适当调整。将最佳浓度（0.1 g/100 mL）的氨基酸和葡萄糖加入无菌水制成发酵液，均匀喷洒在烟叶上，使最终含水率为35%。对照为未加微生物处理，其余处理均与实验组相同。
       1.5.3多因素组合优化

　　参照苏加坤等[20]方法并适当调整。接种1%产多酚氧化酶菌株、0.1 g/100 mL氨基酸和葡萄糖，加入无菌水制成接种液，均匀喷洒在烟叶上，使最终含水率为35%。对照为未加微生物处理，其余处理均与实验组相同。

　　2结果与分析

　　2.1菌株的筛选

　　利用以绿原酸为唯一碳源的筛选平板，特异性筛选获得能降解绿原酸的菌株。观察发现，菌株呈白色圆球状，表面不光滑（见图1）。对菌株的16S rDNA片段进行特异性扩增获得序列，使用NCBI基于web的BLAST进行全基因组BLAST比较。利用MAGA11软件对发酵菌株进行序列比对并构建系统发育树（见图2）。通过NCBI数据库比对发现，该菌株与芽孢杆菌属同源度为99%。将纯化后的菌株接种于发酵培养基，发酵72 h测定PPO酶活性为35.6 U/mL。

　　2.2美拉德产物荧光分析

　　2.2.1氨基酸荧光强度分析

　　实验数据表明，不同性质氨基酸在美拉德反应中生成的荧光产物强度存在显著差异（见图3）。空白对照组（pH=7）中，平均荧光强度为232.7。酸性氨基酸中，谷氨酸平均荧光强度为224.6，天冬氨酸为237.6。中性氨基酸中，甘氨酸平均荧光强度为228.03，色氨酸为204.99。碱性氨基酸中，赖氨酸平均荧光强度为295.13，精氨酸为242.23。赖氨酸荧光强度最高，表明其在美拉德反应中可能更易生成荧光产物，反应充分，且产物稳定性较高。由此猜测，碱性氨基酸可能更有利于美拉德反应。该结论与王楠楠[21]研究一致。

　　2.2.2糖类荧光强度分析

　　实验数据表明，糖类还原性对美拉德反应产物的荧光特性影响显著（见图4）。还原糖中，葡萄糖平均荧光强度为265.6，麦芽糖为235.13。非还原糖中，蔗糖平均荧光强度为247.2，淀粉为231.26。葡萄糖的醛基直接参与反应，荧光强度较麦芽糖高13.0%。研究证实，还原糖具有更高反应效率。究其原因，可能是还原糖在美拉德反应过程中提供碳源，使得反应产物增加，强化褐变，最终增强整体风味。该结论与袁桥娜[22]研究一致。单因素实验优化了美拉德反应条件。荧光强度测定结果表明，初始pH 7.0、葡萄糖和赖氨酸为最佳条件。在此条件下，紫外吸光度显著高于其他组合，表明美拉德反应产物的生成量最大。

　　根据上述结论，设置4个实验组：CK（空白对照组)、J（加菌液组）、F（加发酵液组）、JF（加菌液和发酵液组）。参照苏加坤等[20]方法并适当调整，接种1%产多酚氧化酶菌株、0.1 g/100 mL氨基酸和葡萄糖，加入无菌水制成接种液，均匀喷洒在烟叶上，使最终含水率为35%。对照为未加微生物处理，其余处理均与实验组相同。发酵7 d后，测定色度和香气，结果如下。

　　2.3多酚氧化酶与美拉德反应对烟叶色度的影响

　　通过色度仪测定不同处理组烟叶的L（亮度）及总色差ΔE，结果如图5、6所示。

　　对照组（CK前）经多酚氧化酶单独处理后，L降至39.23（降幅8.3%）；联合处理组（JF组）进一步降至37.46（降幅12.4%），显著低于CK组，表明酶与发酵液协同作用可更高效降低亮度，使烟叶趋近深色雪茄的理想范围。

　　实验包含类胡萝卜素降解产物、苯丙氨酸降解产物、美拉德反应产物、叶绿素降解产物及其他中性香气成分。从香气种类看，发酵前后不同组别中，叶绿素降解产物含量最高；其次是类胡萝卜素降解产物。进一步分析，类胡萝卜素降解产物以法尼基丙酮、二氢猕猴桃内酯为主要物质；苯丙氨酸降解产物以苯乙醛、苯乙醇为主要物质；美拉德反应产物以吲哚为主要产物；叶绿素降解产物以新植二烯为主要物质；其他中性香气成分以香紫苏醇为主要物质。这些香气成分在雪茄烟叶发酵过程中至关重要，对香气风格起着显著作用。

　　烟叶发酵前后，JF组新增3种香气物质：紫罗兰醇、吡咯、十二醛（见图8）。紫罗兰醇为类胡萝卜素降解产物，主要表现为柔和的花香和果香。吡咯为美拉德反应产物，具有类似焦糖的微甜香气，并带有轻微的烤坚果或烘焙谷物气息。十二醛主要表现为柑橘和花香基调。JF组与对照组对比，香气总量增加55%。大多数对烟叶香气有益的物质含量均有所增加，表明添加物对烟叶增香有益，当植物醇从5.84μg/g增加到16.8μg/g，植物醇有很弱的花香和香脂香气，增加了烟叶香气丰富度。石竹素发酵后，含量由4.1μg/g增至16.42μg/g，主要为木香，并有龙涎香似的香韵。结果表明，添加产多酚氧化酶菌株和发酵液的烟叶发酵比添加等量水的烟叶发酵更能提升烟叶品质。

　　3讨论与结论

　　本研究通过探究PPO与美拉德反应在深色雪茄烟叶发酵中的协同作用，揭示了二者对烟叶色泽、香气及感官品质的调控机制。通过单因素实验优化发酵工艺参数，探讨了二者对烟叶色泽与香气品质的调控规律。实验结果表明，在37℃、湿度35%、菌液接种量1%、赖氨酸与葡萄糖浓度均为0.1 g/100 mL、pH 7的条件下，烟叶总色差值较对照组提升6倍，香气总量增加55%，证实了酶促褐变与非酶褐变的协同效应对深色雪茄的品质提升有显著作用。

　　从色泽形成机制看，PPO通过催化多酚类物质氧化生成醌类化合物，再经非酶促聚合形成深褐色素。该过程与美拉德反应中还原糖（葡萄糖）和碱性氨基酸（赖氨酸）生成类黑精的路径形成协同。赖氨酸作为碱性氨基酸，其氨基在美拉德反应中表现出更高的反应活性。荧光强度分析显示，其产物稳定性显著优于其他氨基酸。葡萄糖作为还原糖，其醛基直接参与反应，较非还原糖（如蔗糖）更高效地生成荧光产物，印证了还原糖在非酶褐变中的核心作用。

　　在香气物质调控方面，JF组新增紫罗兰醇、吡咯、十二醛3种关键风味成分。其中，紫罗兰醇作为类胡萝卜素降解产物，贡献柔和的花香和果香；吡咯作为美拉德反应特征产物，带来焦糖和烤坚果香气；十二醛则以柑橘和花香基调增强烟香层次感。此外，植物醇、石竹素等含量显著提升，表明PPO介导的大分子降解与微生物代谢共同促进了香气前体转化，验证了微生物发酵在改善烟叶感官品质中的独特优势。

　　综上，通过PPO与美拉德反应的协同调控能有效促进深色物质生成，新增关键风味成分，并显著改善烟叶感官品质，为深色雪茄工业化生产提供理论依据和技术路径，助力提升国产雪茄的品质与市场竞争力。

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