摘要：文章旨在利用薄膜过滤法为抑菌性原辅料建立便捷、高效的微生物限度检测方法，为生物制品中原辅料的检定放行及微生物风险控制提供数据支撑。采用薄膜过滤法，对硫氰酸钾、四硼酸钠（十水）及苯甲基磺酰氟3种抑菌性原辅料展开微生物限度检测的方法适用性试验。结果显示，上述3种原辅料的各5种试验菌的回收率均在50%～200%范围内，符合《中华人民共和国药典》（2020年版）要求。薄膜过滤法可用于上述3种抑菌性原辅料的微生物限度检测，为生物制品中原辅料微生物限度检测体系的全面建立提供基础数据，促进微生物风险控制的关口前移。

　　关键词：微生物限度；原辅料；薄膜过滤法；过程控制；质量控制

　　2023年2月，国家药监局药审中心（CDE）发布的《非无菌化学药品及原辅料微生物限度研究技术指导原则（试行）》，提出在非无菌化学药品及原辅料领域建立微生物限度控制策略并制定科学、合理的标准，再次强调微生物限度在产品质量控制中的重要性[1]。

　　微生物限度检查包括平皿法、薄膜过滤法和最大概率数（most probable number，MPN）法。薄膜过滤法因操作简便、检测效率高，且无需引入其他化学试剂等优势，在药品及生物制品微生物检验中占据核心地位[2-3]。通过薄膜过:滤法对抑菌性原辅料进行微生物限度检测的方法适用性试验，可为微生物检测体系的建立提供基础数据，对原辅料的微生物控制具有重要意义。

　　1材料与方法

　　1.1原辅料产品

　　硫氰酸钾：购自广东广式试剂科技有限公司；四硼酸钠（十水）：购自国药集团化学试剂有限公司；苯甲基磺酰氟：购自SIGMA。

　　1.2仪器设备

　　生物安全柜（型号：BSC-1600IIA2）：购自苏净安泰；微生物检验仪（型号：HTY-305SP）：购自浙江泰林；恒温恒湿箱（型号：CLC707-ECO）：购自3M。

　　1.3实验菌种

　　实验菌种：铜绿假单胞菌CMCC（B）10104、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501、黑曲霉CMCC（F）98003、白念珠菌CMCC（F）98001，均购自中国食品药品检定研究院。

　　1.4试剂与耗材

　　pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液，购自北京奥博星；含0.05%聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，公司自配；胰酪大豆胨琼脂培养基，购自北京奥博星；滤杯，购自密理博；滤膜，购自密理博。实验所用滤膜材质为PVDF（聚偏二氟乙烯），具有良好的化学稳定性。

　　2方法与结果

　　2.1样品溶液制备

　　取硫氰酸钾、四硼酸钠及苯甲基磺酰氟各40 g，分别加入400 mL pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液溶解，制成1∶10样品溶液。

　　2.2菌悬液制备

　　将1.3实验菌种稀释成浓度为100 CFU/mL的菌悬液。因黑曲霉含有黑色菌丝，为避免影响后续比浊，用含0.05%聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液将孢子洗脱，取带有过滤菌丝装置的无菌毛细吸管吸出孢子悬液再进行后续稀释。其他菌种用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释。

　　2.3样品组

　　样品组为1∶10样品溶液。其中，苯甲基磺

酰氟取样品1 mL于含100 mL pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的滤器中过滤，用300 mL pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分3次冲洗；硫氰酸钾及四硼酸钠取样品10 mL过滤，用100 mL pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗。每种样品各过滤2张滤膜：一张滤膜过滤冲洗后接种于胰酪大豆胨琼脂培养基平板；另一张滤膜过滤冲洗后接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板。

　　2.4试验组

　　样品过滤后，向滤杯中加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为冲洗液，再分别于冲洗液中加入0.1 mL理论浓度为100 CFU/mL的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白念珠菌、黑曲霉5种菌悬液，制成样品加菌悬液，过滤。样品过滤量及冲洗量同2.3样品组。每种样品加菌悬液各制备6个重复，检测后计算菌落回收率及6次试验菌落回收率的相对标准偏差（SRSD）。过滤金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的滤膜分别接种于胰酪大豆胨琼脂培养基平板，在30～35℃下培养3 d观察结果并计数；过滤白色念珠菌、黑曲霉菌的滤膜分别接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，在20～25℃下培养5 d观察结果并计数。

　　2.5阳性对照

　　在100 mL pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中分别加入0.1 mL理论浓度为100 CFU/mL的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白念珠菌和黑曲霉菌5种菌悬液，各制备2个重复。接种培养基及培养条件同2.3样品组。

　　2.6阴性对照

　　取pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液和含0.05%聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液200 mL过滤，分别接种于胰酪大豆胨琼脂培养基平板和沙氏葡萄糖琼脂培养基平板。

　　2.7试验结果

　　3种原辅料的菌落回收率及6次试验菌落回收率的SRSD如表1所示。样品及阴性对照均未观察到有菌落生长；试验组及阳性对照分别观察到相应试验菌落的生长，且每种原辅料的菌落回收率在50%~200%范围内，6次重复回收率的SRSD≤20%，符合《中华人民共和国药典》（2020年版）要求[4]。

　　3讨论

　　对生物制品所用原辅料进行微生物质量控制，是保证生物制品安全性的重要举措，对筛选合格供应商、从源头优化生产工艺具有重要意义[5-6]。目前，关于药用原辅料微生物限度的方法适用性研究较少，且溶解性及抑菌作用的不同，决定了微生物限度检测方法的差异性选择。因此，需要加强对原辅料微生物限度检测的方法适用性研究，为原辅料微生物限度检测体系的建立提供基础数据[7]。

　　当前，常用培养基稀释法、中和剂法、薄膜过滤法去除样品抑菌性。对于具有抑菌性的原辅料，在样品阶段加菌，可能会因验证菌株对抑菌物质不耐受导致菌落回收率无法达标，并不能代表检测方法的不适用[8]；在冲洗液阶段加菌，既能保证样品抑菌作用的去除，又可保留微生物被冲洗的过程，是较科学的研究方法[9]。此外，适当增加冲洗量，如每膜冲洗量增至300 mL或500 mL，有助于减少抑菌物质残留，平衡渗透压、离子浓度及pH等因素，促进被检微生物生长[10]。

　　药用原辅料种类繁杂、理化特性不一。对于不能溶解、无法过滤的抑菌性原辅料，需要使用中和剂进行处理。已有研究[11-13]显示，卵磷脂和聚山梨酯80对抑菌性中药制剂、1%聚维酮碘、炉甘石洗剂等的中和作用显著。以含0.3%卵磷脂和3%聚山梨酯-80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释液，冲洗液可有效提高菌落回收率，且随着样品抑菌强度加大，卵磷脂和聚山梨酯80的浓度可相应提高至0.5%和5%[14]。针对不同原辅料开展方法适用性研究，选择适宜的微生物限度检测方法，有助于加强生物制品微生物质量的过程控制，早期发现微生物质量风险，助力企业高质量发展。

参考文献

　　［1］赵磊,李珊珊,许真玉.《非无菌化学药品及原辅料微生物限度研究技术指导原则(试行)》的介绍［J］.沈阳药科大学学报,2023,40(12):1621-1626.

　　［2］路学美,唐玉竹.薄膜过滤法在药品检验中的应用研究［J/OL］.中文科技期刊数据库（文摘版）医药卫生,2022(9)［2022-09-01］.

　　［3］姜颖,王鸿昌.薄膜过滤法在药品检验中的应用分析［J/OL］.中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生,2022(7)［2022-07-01］.

　　［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2020年版四部［M］.北京:中国医药科技出版社,2020.

　　［5］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2020年版三部［M］.北京:中国医药科技出版社,2020.

　　［6］赵良子.抑菌性药品微生物限度检查［D］.大连:大连工业大学,2016.

　　［7］庞云娟,刘康连,梁晓玲,等.药品微生物限度检查方法适用性的研究进展［J］.药物分析杂志,2024,44(8):1285-1292.

　　［8］马仕洪,刘鹏,杨利红,等.药品微生物限度检查方法适用性试验中加菌方式的实验研究［J］.药物分析杂志,2018,38(5):877-882.

　　［9］任颖慧,曹鲁娜,赵蕊蕊,等.药品微生物限度检查方法适用性中存在的问题及改进建议［J］.中国药物经济学,2022,17(6):124-128.

　　［10］李翠,闵红,谢毓华,等.莫匹罗星软膏微生物限度检查方法适用性研究及水分活度测定［J］.中国药业,2022,31(5):76-79.

　　［11］姬俊,牛萌萌,王立云,等.11种液体医院制剂微生物限度方法的研究［J］.中国医药科学,2022,12(3):133-136.

　　［12］姬俊,刘婷婷,牛萌萌,等.卵磷脂和聚山梨酯-80联用在中药制剂抑菌活性中的中和作用［J］.中国药师,2017,20(3):586-588.

　　［13］廖祥茹,陈晨,李旸,等.聚山梨酯80在微生物限度检查中的应用［J］.中国药师,2014,17(10):1776-1777.

　　［14］张光华,余立.聚山梨酯80和卵磷脂在化学药微生物限度检查时的中和作用［J］.药物分析杂志,2008,28(7):1127-1130.