摘要：在消费者健康意识日益增强的当下，除菌功能成为洗衣机产品的核心价值之一。深入了解洗衣机菌群分布状况，有助于解决其实际应用中存在的微生物污染问题。文章旨在利用高通量测序技术解析中国家庭洗衣机中真菌群落结构，从56个洗衣机样品中共测序得到3 371 665条测序序列标签（Tags）和4 493操作分类单元（OTU），来自309个属。其中，曲霉属（Aspergillus）、紫霉属（Purpureocillium）、杯梗孢属（Cyphellophora）、克努菲亚属（Knufia）、枝孢霉属（Cladosporium）、节丛孢属（Arthrobotrys）、马拉色菌属（Malassezia）、赭霉属（Ochroconis）、脉孢霉属（Neurospora）、链格孢属（Alternaria）是排名前10的菌属。同时，系统比较分析了影响洗衣机中真菌多样性的因素。

　　关键词：中国家庭；洗衣机；高通量测序；真菌群落结构

　　随着消费者健康意识持续提升，洗衣机的除菌、除螨等健康功能成为消费者关注的焦点。调研家用洗衣机中的微生物群落状况，为洗衣机抗除菌技术升级，构建科学、健康的洗护生态环境奠定了坚实基础[1-2]。

　　CAO等[3]选取我国4个城市的洗衣机样本展开微生物多样性研究，并发现4个城市因地域不同，分别代表4种不同气候：北京代表气候相对干燥的北方内陆城市；青岛代表北方沿海城市；广州代表全年温度较高的珠江三角洲地区；无锡地区（包括徐州、上海）代表气候相对温和的长江三角洲地区。在此基础上，探讨了洗衣机中的细菌群落结构。本文利用高通量测序技术，分析了相同洗衣机样本中的真菌群落结构组成。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　研究共收集来自无锡、广州、青岛、北京4个地区的14台家用洗衣机，并对其展开微生物分析。

　　1.2样品采集

　　在洗衣机污染较严重的料盒、出水口、外筒内壁、内筒外壁、门封圈5个位点，用棉拭子涂抹法实施样本采集。

　　利用非培养分析技术，提取采集样品的宏基因组，通过ITS1基因扩增子测序，解析洗衣机样品中的真菌群落结构。

　　取30 ng宏基因组DNA样本，使用对应融合引物进行PCR扩增。扩增产物经Agencourt AMPure XP磁珠纯化后，重悬于洗脱缓冲液，完成文库构建。文库片段大小分布及浓度通过Agilent 2100 Bioanalyzer检测。针对检测合格的文库，依据其插入片段长度，选用适配的HiSeq平台进行扩增子测序分析。

　　2结果

　　2.1样品采集

　　本研究用棉拭子涂抹法采样57份，分析其真菌群落结构。样本的具体信息和编号如表1所示。

　　2.2洗衣机样品中真菌群落结构解析

　　利用QIAGEN DNA提取试剂盒完成了57个样品宏基因组的提取。通过核酸质检、PCR扩增、文库构建和文库质检发现，除F_72号样品（上海滚筒洗衣机的外筒内壁）因PCR产物浓度太低无法完成文库构建，其余56个样品均通过文库质检，进行了16S rRNA基因V3～V4区扩增子测序分析。Tag数目与样品中的生物量呈正相关：56个样品共测序获得3 371 665条Tag，数目在36 000～65 000；76.7%样品超60 000，最高Tag数目的样品来自料盒。OTU数目与样品中生物多样性呈正相关：56个样品共测序获得4 493 OTU，数目在30～220；最高OTU数目的样品来自出水口。

　　门水平分析显示，洗衣机中的真菌主要来自子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota），如图1所示。

　　在属水平上分析物种组成发现，洗衣机中的真菌来自309个属。其中，曲霉属（Aspergillus）、紫霉属（Purpureocillium）、杯梗孢属（Cyphellophora）、克努菲亚属（Knufia）、枝孢霉属（Cladosporium）、节丛孢属（Arthrobotrys）、马拉色菌属（Malassezia）、赭霉属（Ochroconis）、脉孢霉属（Neurospora）、链格孢属（Al-ternaria）是排名前10的菌属（见图2），也是后续研究重点关注的真菌。

　　2.3洗衣机样品中真菌群落结构的影响因素分析

　　洗衣机的地理位置按照4个城市和南北方分类，包括波轮和滚筒2种；使用频率分为每周1～2次、每周3～4次和每周5～7次3组；使用年限分为5年以上、6～9年和10年以上3组；采样位置分为内筒外壁、外筒内壁、门封圈、料盒和出水口5个。单因素方差分析显示：不同类型、使用习惯、使用年限和采样位置对样品真菌总数和多样性均无显著影响；地理位置（不同城市）对样品真菌多样性（Shan-non指数）的影响显著（P=0.017和P=0.002），是影响洗衣机真菌多样性的关键因素，具体分析结果如表2所示。

　　3讨论

　　在鉴定获得的真菌时，需重点关注对洗衣机及人体健康有影响的菌株，包括产生物膜特性的菌株和具有条件致病性的菌株。

　　本研究发现，具有产生物膜特性的真菌包括：曲霉属（Aspergillus）、链格孢属（Alternaria）、枝顶孢霉属（Acremonium）。具体而言，曲霉属（Aspergillus）在不同城市、不同类型、不同位点、不同使用年限的洗衣机中均是相对丰度最高的属，菌丝体可形成生物膜[4]；链格孢属（Alternaria）主要分布于料盒、内筒外壁，易在饮用水系统中形成生物膜；枝顶孢霉属（Acremonium）在洗衣机的料盒和外筒内壁中有分布，可形成生物膜。

　　在鉴定出的真菌中，部分真菌菌株会引起人类疾病。其中，曲霉属（Aspergillus）、枝孢霉属（Cla-dosporium）的分布范围最广，覆盖洗衣机的5个位点。曲霉属（Aspergillus）可侵害家禽、家畜甚至人体呼吸道器官。枝孢菌属（Cladosporium）在洗衣机的外筒内壁、出水口、料盒、内筒外壁、密封圈中均有分布，是相对丰度排名前10的菌属，可形成生物膜，引起呼吸系统疾病患者或哮喘病患者的过敏反应，长期接触可导致免疫系统退化[5]。皮状新丝孢酵母（Cutaneotrichosporon）为临床常见报道菌，可感染免疫低下人群，引起皮肤、呼吸系统等疾病，相对丰度略低。赭霉属（Ochroconis）在洗衣机的外筒内壁、出水口、料盒、内筒外壁、密封圈中均有分布，同时也是相对丰度排名前10的菌株。该菌属常见的分离源为呼吸道、表皮组织，可能导致真菌病[6]。青霉属（Penicillium）相对丰度偏低，部分种可引起呼吸道、外耳、泌尿系统感染[7]。枝顶孢霉属（Acremonium）除易生成生物膜，还具有致病性，易感染人类，出现肿块、脓疱、丘疹、破溃伴局部瘙痒等症状。可致病真菌菌株多分布在料盒、内筒外壁、外筒内壁等位点，形成的生物被膜可直接与衣物家纺等物品接触，造成衣物污染，影响人体健康。

　　本研究结果与曹运奕等[8]用平板培养法分离鉴定真菌的结果相比，部分高度一致。例如，平板培养法鉴定的真菌与扩增子测序鉴定的真菌相同的优势真菌菌属为：曲霉属（Aspergillus）、紫霉属（Purpure-ocillium）、枝孢霉属（Cladosporium）、赭霉属（Ochro-conis）。

　　4结论

　　通过高通量测序分析，56个样品共测序获得3 371 665条Tag和4 493 OTU，来自309个属。其中，曲霉属（Aspergillus）、紫霉属（Purpureocillium）、杯梗孢属（Cyphellophora）、克努菲亚属（Knufia）、枝孢霉属（Cladosporium）、节丛孢属（Arthrobotrys）、马拉色菌属（Malassezia）、赭霉属（Ochroconis）、脉孢霉属（Neurospora）、链格孢属（Alternaria）是相对丰度排名前10的真菌菌属。

　　比较分析地理位置、类型、取样部位、使用年限对洗衣机中真菌多样性的影响，发现地理位置是影响洗衣机中真菌多样性的重要因素。

　　洗衣机中需要重点关注的真菌菌株包括具有产生物膜特性和条件致病特性的菌株。其中，产生物膜特性真菌菌株包括曲霉属（Aspergillus）、链格孢属（Alternaria）、枝顶孢霉属（Acremonium）等；条件致病特性真菌菌株包括曲霉属（Aspergillus）、枝孢霉属（Cladosporium）、赭霉属（Ochroconis）、皮状新丝孢酵母属（Cutaneotrichosporon）、青霉属（Penicillium）、枝顶孢霉属（Acremonium）等。

参考文献

　　［1］侯婷婷.健康、智能再进阶让洗衣机具有高溢价能力［J］.家用电器,2021(5):76-77.

　　［2］苏亮.致净生活·健康呵护洗衣机细分市场积蓄新动能［J］.家用电器,2019(11):100-101.

　　［3］CAO Y Y,YUAN S,PANG L L,et al.Study on microbial diversity of washing machines［J］.Biodegradation,2024,35(6):819-831.

　　［4］SANGEETHA B A,ABDEL-HADI A,HASSAN S A,et al.Evaluation of in vitro activities of extracellular enzymes from Aspergillus species isolated from corneal ulcer/keratitis［J］.Saudi Journal of Biological Sciences,2020,27(2):701-705.

　　［5］余进,万喆,鲁巧云,等.红色毛癣菌和枝孢样枝孢霉混合感染导致银屑病患者甲真菌病1例［J］.中国真菌学杂志,2009,4(5):298-300.

　　［6］吕桂霞,刘维达,沈永年,等.夏胡许赭霉引起的暗色丝孢霉病一例［C］//中华医学会.2007中华医学会第二次医学真菌学术会议暨医学真菌实验室研究技术新进展学习班论文汇编.中国医学科学院皮肤病研究所,2007:159-160.

　　［7］王丽娅,张月琴,王刚生,等.我国真菌性角膜病高发区致病真菌种类调查［J］.河南医学研究,2000(4):357-359.

　　［8］曹运奕,张晶晶,高源,等.基于可培养技术的中国家用洗衣机中真菌多样性研究［J］.中国标准化,2023(5):223-228.