摘要：脂肪性状是养猪业最重要的经济性状之一。该研究基于基因表达公共数据库GEO数据库中瘦肉型猪（长白猪）和脂肪型猪（荣昌猪）皮下脂肪组织的基因表达数据集GSE30343，利用加权基因共表达网络分析等方法挖掘与猪脂肪沉积相关的重要基因和信号通路。结果显示，共识别出4个基因共表达模块，其中，宝蓝色模块为与皮下脂肪最显著相关模块（r=0.94，P=5E-17），并识别出8个与脂肪形成相关的重要基因，分别为GPAT、ACACA、ACLY、SCD、FASN、ACSS2、ME1和SCD5，这些基因主要参与有机酸代谢合成、脂肪酸代谢合成、AMPK等信号通路。该研究挖掘出了与不同脂肪类型猪脂肪沉积相关的重要基因，为利用分子手段对猪脂肪性状进行遗传改良提供了潜在候选基因。

　　关键词：脂肪沉积；皮下组织；WGCNA；基因

　　0引言

　　脂肪性状是养猪业最重要的经济性状之一，脂肪沉积的多少与猪肉品质以及繁殖性能等密切相关，直接关乎养猪生产和经济效益。对于人而言，脂肪过度沉积则可引起人类肥胖，以及由其引发的高血压、糖尿病等心血管疾病，严重危害人类健康。根据解剖学，脂肪组织可主要分为内脏脂肪组织（VAT）和皮下脂肪组织（SAT），二者在形态和功能上存在明显差异，VAT主要与炎症和免疫反应有关，而SAT则主要与能量代谢与平衡有关。

　　在养猪生产上，尤其是我国大多数地方猪种，SAT脂肪沉积量大，降低SAT脂肪沉积一直是育种工作的重要目标，但由于脂肪性状是复杂性状，单纯利用常规育种手段对该性状进行遗传改良的难度较大。近年，随着分子生物学和生物信息学等相关技术的发展，人们从分子水平认识脂肪性状形成的分子机理，进而利用分子手段对脂肪性状进行遗传改良成为了可能。目前，关于猪皮下脂肪形成的分子机制，尽管获得了一些研究进展，但仍不清楚。

　　1研究背景

　　加权基因共表达网络分析（WGCNA）是一种通过对基因表达模式分析和对表达模式相似的基因进行聚类，进而鉴定与表型关联的重要基因模块和重要基因的方法，是揭示复杂性状分子机制最为常用和有效的方法之一。目前，WGCNA方法已广泛应用于人类复杂疾病和动植物重要经济性状分子机制的研究上，例如，Tian Z等通过利用WGCNA方法对GEO数据库中的乳腺癌相关数据集分析，筛选出了7个枢纽基因，其中，4个基因为与乳腺癌预后相关的关键基因，包括FAM171A1、NDFIP1、SKP1和REEP5。Wang Y等利用WGCNA方法构建了水稻耐热应激和易热应激的基因共表达网络，并鉴定出与水稻幼苗热应激相关的重要基因。Wang J等使用WGCNA方法分析了绵羊卵巢4个发育阶段的转录组数据，筛选出了与多胞胎卵泡发育相关的功能模块和关键基因。在牛上，Feng X等[7]利用WGCNA方法发现了与脂肪沉积相关的2个重要基因模块，识别出3个基因包括TCAP，MYH1和TNNC1可能是调节肌内脂肪沉积的重要基因。但目前，关于利用WGCNA方法对猪皮下脂肪形成机制的研究尚不多，仍需要进一步深入探讨。

　　由于中国大多地方猪种和西方常用猪种在皮下脂肪沉积特性上的差异，利用比较分析策略研究2类猪种脂肪组织的形成差异可能是揭示脂肪性状分子机制的有效方法。基于此，本研究基于公共基因表达数据库GEO中的瘦肉型长白猪和脂肪型荣昌猪皮下脂肪组织相关基因表达数据集，通过利用差异表达分析（DEGA）、WGCNA、蛋白与蛋白互作（PPI）网络分析以及中心性分析等方法，挖掘与猪皮下脂肪沉积的重要基因共表达模块和重要基因，为利用分子育种手段对猪脂肪性状进行遗传改良提供潜在候选基因，同时，也为人类肥胖形成机制研究提供一定的参考和借鉴。

　　2方法

　　2.1数据来源

　　本研究基因表达数据集来源于美国生物技术信息中心（NCBI）公共基因表达数据库（GEO）中的数据集GSE30343[1]，选择该数据集中长白猪和荣昌猪的皮下脂肪组织进行分析，每个品种共包括18个样品，该数据集产生于Agilent-020109猪基因表达芯片平台（44k）。

　　2.2差异表达基因分析

　　利用基于R软件的limma包（version 3.56.2）对分组数据进行差异表达基因分析，以FDR<0.05和|log2（fold change）|>1为标准筛选差异表达基因（DEGs）。利用基于R软件的ggplot2软件包（version 3.4.3）对DEGs的表达水平和分布进行可视化。

　　2.3 WGCNA分析

　　使用基于R软件的WGCNA包（version1.72-1）进行基因共表达网络分析。其基本过程：首先，利用皮尔逊相关系数计算基因间的表达相似性，并据此将表达矩阵转换为相关矩阵；其次，将相关矩阵转换为邻接矩阵，使用pickSoftThreshold函数筛选合适的软阈值(β),使基因表达关系符合无尺度网络；再次，基于基因间的关联程度指标即拓扑重叠尺度（TOM）将邻接矩阵转化为拓扑矩阵，基于TOM的相异度（1-TOM）指标对基因进行层次聚类，将表达模式相似的基因划归为同一基因模块；最后，利用动态剪切算法对基因共表达模块进行识别。

　　2.4功能富集分析

　　基因功能分析采用基于基因本体论（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）的通路富集方法进行，其中，GO分析包括生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）3个方面。GO和KEGG通路富集分析使用基于R软件的clusterProfiler软件包（version 4.8.1）进行，P＜0.05或0.01被认为该通路被显著或极显著富集。

　　2.5 PPI网络构建和重要基因识别

　　使用PPI网络分析方法对基因间的互作关系进行分析，基因间的互作关系信息来源于在线的功能蛋白关联网络数据库String（https://cn.string-db.org/，version 11.5）。使用Cytoscape（version 3.9.1）软件构建PPI网络，使用其插件MCODE（version 2.0.2）识别PPI网络中的重要模块和基因。

　　3结果

　　3.1差异表达基因的识别

　　通过差异表达基因分析，在长白猪和荣昌猪的皮下脂肪组织中共识别出219个DEGs，其中，在荣昌猪中共有108个基因显著上调和111个基因显著下调。219个DEGs的表达分布和在2个猪种中的表达水平分别见图1a和图1b。

　　3.2基因共表达模块识别

　　基因共表达模块识别使用WGCNA方法。基于R2=0.85的无尺度拓扑标准，最佳软阈值β为10（图2a），层次聚类共识别到黄色、棕色、蓝色和宝蓝色4个基因共表达模块（图2b），灰色模块为不能归类到上述4个模块中的基因模块，在这4个模块中，以宝蓝色模块与脂肪性状的相关显著性最高（r=0.94，P=5E-17，图2c），模块基因与脂肪性状呈现较高的相关显著性（r=0.89，P＜1E-200）（图2d），该模块被选为与猪皮下脂肪性状相关的重要基因共表达模块。

　　3.3基因功能富集分析

　　在宝蓝色模块中共包括1 237个基因，与219个DEGs比较，有176个基因是共同的。GO和KEGG分析显示，这176个基因极显著富集到150条GO条目和18条KEGG信号通路上（P＜0.01），最显著富集（P值最小）的前10个GO条目和前10个KEGG通路详细信息见表1和表2。富集通路主要与单羧酸合成和代谢、羰酸代谢、有机酸合成和代谢、羧酸合成和代谢、脂肪酸合成和代谢、受体配体活性、信号受体激活剂活性、信号受体调节活性、PPAR信号通路、AMPK信号通路等相关。

　　3.4 PPI网络构建及重要基因识别

　　对176个共同基因的互作关系进行分析，基于互作得分为0.7时，176个基因中共有63个基因存在95个互作关系，包含63个节点和95条边的PPI网络被构建（图3a）。MCODE分析显示，得分最高的网络模块包括8个节点和26条边，包含8个节点和26条边的PPI子网络被构建（图3b），这8个节点基因分别为GPAT、ACACA、ACLY、SCD、FASN、ACSS2、ME1和SCD5，被识别为与猪皮下脂肪相关的重要基因。

　　4讨论

　　利用生物信息学方法通过比较分析长白猪和荣昌猪皮下脂肪组织的基因表达谱，初步识别出8个基因GPAT、ACACA、ACLY、SCD、FASN、ACSS2、

　　ME 1、SCD5为与猪皮下脂肪沉积相关的重要基因。GPAT基因编码甘油-3-磷酸酰基转移酶，在脂肪酸生物合成中参与甘油三酯的生成，该基因可将甘油3-磷酸和酰基辅酶A转化为1-酰基甘油-3-磷酸，在哺乳动物脂肪沉积和能量消耗方面发挥重要作用。ME1编码苹果酸脱氢酶，该酶能够催化产生用于脂肪酸生物合成的NADPH，该酶催化苹果酸和丙酮酸的相互转化，能够将糖酵解和柠檬酸循环过程联结起来。ACLY基因编码ATP柠檬酸裂解酶，该酶在ATP和CoA存在条件下参与糖酵解过程产生乙酰辅酶A和草酰乙酸，连接葡萄糖和脂质代谢过程。ACACA基因编码乙酰辅酶A羧化酶α,该酶可催化乙酰辅酶A羧化为丙二酰辅酶A，此过程为脂肪酸合成的限速步骤。FASN基因编码脂肪酸合酶，FASN在NADPH存在下催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A转化为长链饱和脂肪酸。SCD编码硬脂酰辅酶A去饱和酶，是合成单不饱和脂肪酸的限速酶。SCD5为SCD的一种亚型，主要催化饱和脂肪酸硬脂酰辅酶A和棕榈酰辅酶A形成单不饱和脂肪酸。ACSS2为酰基辅酶A合成酶短链家族成员2，在脂肪细胞中通过转化乙酸来生成乙酰辅酶A。鉴于这些基因在脂类代谢过程中的作用，目前，这些基因已作为与脂肪性状相关的候选基因进行深入研究，例如，Piórkowska K等研究发现，ACACA、FASN、SCD基因的多态性与猪的脂质代谢、肌内脂肪含量以及屠宰性能相关；ACACA、SCD基因被证实与荷斯坦牛奶中的脂肪酸组成以及山羊的产奶性状显著关联。目前研究显示，脂质代谢异常也与一些疾病密切关联，例如肝癌等，目前已有研究将ACLY、ACACA、FASN、SCD作为肝细胞癌治疗的潜在靶点。FASN能够驱动脂肪从头合成并介导促炎和纤维化信号，在非酒精性脂肪性肝炎中常用作治疗靶点。此外，也有一些研究报道这些基因在预防和治疗一些癌症和代谢综合症的作用。

　　研究显示，本研究识别的8个基因与脂肪性状明显相关，但一些基因的具体功能及机制仍未被深入了解，接下来将重点对8个基因与猪皮下脂肪性状的确切关系进行深入研究。

　　5结论

　　本研究基于WGCNA等方法初步识别出与猪皮下脂肪性状最显著相关的基因共表达模块及8个重要基因GPAT、ACACA、ACLY、SCD、FASN、ACSS2、ME1、SCD5，研究结果可为利用分子手段对猪皮下脂肪性状进行遗传改良提供重要潜在候选基因。

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