摘要：为探讨盐碱胁迫下黄花苜蓿叶片结构的特征变化，揭示解剖结构与其耐盐碱的关系，采用石蜡切片法对龙牧18黄花苜蓿在150 mmol/L NaHCO3和Na2CO3混合盐碱胁迫0、1、6 h和12 h后的叶片解剖结构进行观测，测定叶片的厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、上表皮厚度、下表皮厚度等，计算栅海比、栅栏组织紧密度和海绵组织疏松度，研究不同盐碱胁迫时间对黄花苜蓿叶片结构的影响。结果表明，盐碱胁迫对黄花苜蓿叶片表皮结构、叶肉组织具有显著影响，盐碱胁迫下龙牧18黄花苜蓿叶片的栅栏组织厚度、海绵组织厚度对叶片厚度起主导作用。对上述指标标准化并进行主成分分析，龙牧18黄花苜蓿盐碱胁迫时提取特征值＞1的3个主成分，累计方差贡献率达83.523%。

　　关键词：黄花苜蓿；叶片；解剖结构；盐碱胁迫

　　0引言

　　土壤盐碱化是限制植物生长发育的非生物因素之一，不仅严重危害作物生产，而且导致土壤退化。当土壤中的盐分积累过多时就会造成盐碱地的形成，据不完全统计，全世界盐碱地面积约为9.543 8亿hm2，其中我国有9 913万hm2，世界上约7%的农业用地受到盐碱化的影响，由于人工灌溉和不适当的土地管理造成了土地盐碱化，预计2050年盐碱化土地占比可能增加到50%。自然环境下，土壤盐碱成分复杂，主要包括以NaCl主的中性盐和以Na2CO3为主的碱性盐，而影响农作物生长的还包括盐类的Na2SO4和碱类的NaHCO3。当前，我国盐碱地面积大，分布广，开发潜力大，要充分发挥盐生植物的作用，发展盐碱农业与生态经济的统一。

　　黄花苜蓿（Medicago falcata L.）是苜蓿属多年生草本植物，对土地的适应性强，在贫瘠的土地上能够良好生长，可通过根瘤菌固氮改良贫瘠土壤，具有抗寒、耐旱和耐盐碱等特点，其产草量较高，用作放牧或打草均可。王俊杰等研究发现，黄花苜蓿总体耐盐碱性强于紫花苜蓿，在苜蓿耐盐碱育种中的利用潜力很大，可作为我国盐碱地改良最有前景的草品种之一。当外界环境发生变化时，植物会通过形态结构的变化去适应环境，各器官中叶片是对逆境胁迫反应最敏感，可塑性大。前人的研究发现，叶的解剖结构可作为耐盐碱评价的指标，如叶表皮，栅栏组织和海绵组织可作为耐盐碱指标。黄花苜蓿叶片为异面叶，由表皮细胞、叶肉和叶脉组成，其中主要部分为叶肉，位于上、下表皮之间，包括海绵组织和栅栏组织。栅栏组织细胞排列紧密，紧挨上表皮，而海绵组织位于栅栏组织与下表皮之间，排列疏松不规则，紧挨下表皮。本研究通过设置碱性盐胁迫试验，分析盐碱胁迫对黄花苜蓿叶片解剖结构的影响，旨在为选育耐盐碱性强的黄花苜蓿新品种提供基础种质资源。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　供试材料是龙牧18黄花苜蓿（Medicago falcata L.cv.Longmu No.18）由黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院自主培育的品系，以下简称LM18。选取饱满、有活力的黄花苜蓿种子，先用70%的酒精消毒30 s，再用5%NaClO消毒10 min，最后用蒸馏水冲洗4～5次。将冲洗干净的种子均匀摆放在铺有润湿的滤纸的玻璃培养皿中，放入人工气候培养箱暗培养（25℃/15℃,day/night；湿度，70%），使种子萌发，待苜蓿子叶展开后转入苜蓿培养槽中，每天用改良的Hoagland营养液浇灌，促进幼苗生长。待幼苗长至4～5叶期进行盐碱胁迫处理，盐碱溶液由150 mmol/L NaHCO3和Na2CO3 9:1混合配制，将黄花苜蓿植株转入盐碱溶液中胁迫0、1、6、12 h后，分别剪取各处理植株叶片材料。所取材料快速浸入FAA溶液（福尔马林:乙酸:70%酒精=5 mL:5 mL:90 mL）中固定。

　　1.2方法

　　运用石蜡切片技术，将FAA固定后的叶片组织样本转入酒精溶液脱水，氯仿透明，透明处理后的样本浸蜡，而后石蜡包埋，修整蜡块后使全自动切片机切片，厚度为10～12μm，置于36℃恒温箱过夜烤片，进行番红—固绿双染色。将处理好的切片使用奥林巴斯BX43光学显微镜进行观察，并拍照，利用Motic ImageJ 3.0软件对每个处理照片进行数据测量，测量叶片厚度、上下表皮厚度，栅栏组织和海绵组织厚度，每个样片观察20个视野，每一张样片取得的平均值为一个数据。计算栅海比（栅栏组织厚度/海绵组织厚度）；叶片栅栏组织结构紧密度（CTR）=栅栏组织厚度/叶片厚度×100%；叶片海绵组织结构疏松度（SR）=海绵组织厚度/叶片厚度×100%。

　　1.3数据处理和分析

　　黄花苜蓿叶片解剖数据，采用Microsoft Excel 2010软件进行整理与计算，用SPSS 17.0软件进行方差、相关性、主成分及通径分析。

　　2结果与分析

　　2.1盐碱胁迫对黄花苜蓿叶片解剖结构的影响

　　盐碱胁迫下，由图1和表1可知黄花苜蓿叶片结构发生了变化，可归纳总结为：①随着处理时间的增加，LM18叶片平均厚度呈逐渐变小的趋势，与对照相比分别减少了1.07%、5.05%、24.89%，且处理12 h显著变薄（P＜0.05）；②叶片的上表皮平均厚度与对照相比分别碱少了6.71%、9.58%、22.81%，下表皮的平均厚度与对照相比分别减少了12.86%、15.82%、23.78%，但差异不显著（P＞0.05）；③随着处理时间的增加，栅栏组织和海绵组织均变小，其中栅栏组织的减少幅度分别为11.01%、14.33%、20.96%，海绵组织的减少幅度分别为16.06%、29.90%、35.38%，栅海比值分别为1.439、1.659、1.660；④经盐碱胁迫后，与对照相比处理1、6 h后LM18黄花苜蓿叶片CTR值分别比对照减少了10.00%和9.66%，而处理12 h略有增加，增加了5.25%，但差异不显著（P＞0.05），SR值在盐碱胁迫后比对照分别减少了15.17%、26.21%、14.02%。

　　2.2盐碱胁迫下的黄花苜蓿叶片解剖结构相关性及主成分分析

　　在NaHCO3和Na2CO3混合盐碱胁迫中，LM18叶片各显微结构之间的相关性各异，既有正相关，又有负相关，见表2。由表3可见，LM18在盐碱处理下8个指标主成分分析中，提取特征值＞1的3个主成分，其特征值分别为3.063、2.480和1.139。第一主成分综合了叶片厚、上表皮厚、栅栏组织、海绵组织和SR，方差贡献率为38.288%；第二主成分综合了栅海比和CTR，方差贡献率为30.999%；第三主成分综合了下表皮厚，方差贡献率为14.237%；累积方差贡献率达到85.523%，符合分析要求。由表4可见，在不同盐碱处理时间下，LM18叶片解剖结构的综合得分分别为0.941、0.027、-1.425、0.457，根据得分排序，盐碱处理时间对LM18叶片解剖结构影响程度由高到低依次为对照、12、1、6 h。

　　2.3盐碱胁迫的黄花苜蓿显微结构的通径分析

　　以叶片厚度（Y）为评价指标（LM18的叶片厚度定义为YLM18），以上表皮厚度（X1）、下表皮厚度（X2）、栅栏组织厚度（X3）、海绵组织厚度（X4）为影响因素，进行逐步回归分析盐碱胁迫对LM18叶片的影响。通过线性回归分析得出LM18的回归方程为YLM18=35.739+1.757X1+1.038X2+1.010X3+0.427X4。表5结果表明，LM18各显微结构与叶片厚度的相关系数，由大到小依次为栅栏组织厚度、海绵组织厚度、上表皮厚度、下表皮厚度。以上说明LM18在盐碱胁迫时，是栅栏组织厚度和海绵组织厚度对叶片厚度起主导作用。

　　3讨论与结论

　　植物的生长和发育在盐碱环境中不仅受到盐分高而导致的盐害影响，同时还面临碱性土壤pH值升高所导致的土壤理化性质不良产生的副作用影响。当植物生存环境发生改变时，可通过自身形态结构的变化去适应环境；叶片作为植物中变异性和可塑性最大的组织，在形态上会最先发生变化，是对环境反应最敏感和最明显的器官，是反映植物对环境适应能力的重要指标，叶片解剖结构与植物的耐盐碱性有着密切的关系。通过观察，盐碱胁迫后随着处理时间的增加，LM18叶片厚度、上、下表皮厚度呈现了不同程度的减小，说明叶片结构可能遭到了一定程度的破坏，导致黄花苜蓿叶片厚度的减小，这与李瑞梅等研究的盐胁迫下马齿苋叶片厚度的变化相类似。

　　栅栏组织和海绵组织是植物叶片中的薄壁组织，二者都能够进行光合作用，发达的栅栏和海绵组织可以加强光合作用和提高光合效率，栅栏组织、海绵组织的吸水和失水，可导致叶片厚度的变化。本研究中随着盐碱胁迫时间的增加，LM18黄花苜蓿叶片栅栏组织和海绵组织厚度均出现了减小的趋势，栅栏组织的减小幅度分别为11.01%、14.33%、20.96%，海绵组织的减小幅度分别为16.06%、29.90%、35.38%，然而栅海比分别为1.439、1.659、1.660，表明在叶片厚度变薄的情况下，栅栏组织比例加厚，海绵组织比例变薄，这与田晨霞等研究结果相类似。同时栅海比的逐渐增加，栅栏组织紧实度在盐碱处理12 h的增加以及海绵组织疏松度在不同盐碱胁迫时间下呈现出的减少趋势，均体现出LM18黄花苜蓿对盐碱环境的适应性表现。

　　通过相关性、主成分及通径分析可了解到各指标的密切程度。在盐碱处理中，LM18黄花苜蓿栅栏组织和海绵组织厚度与叶片厚度呈显著正相关（P＜0.05）；通径分析显示栅栏组织厚度、海绵组织厚度对叶片厚度起主导作用；主成分分析显示盐碱处理时间对叶片解剖结构的影响程度；以上分析结果表明LM18黄花苜蓿在盐碱胁迫过程中随着处理时间的增加，叶片栅栏组织变紧密，细胞间隙变小，叶片厚度随栅栏组织、海绵组织厚度的变化而变化显著，这也提示在NaHCO3和Na2CO3混合盐碱环境下在一定程度上会抑制LM18黄花苜蓿的生长。

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