摘要：该试验旨在研究初乳对新生腹泻肉用犊牛的行为、体重、血清中的免疫因子、外周血淋巴细胞亚群及直肠粪便微生物群落的影响。试验选取通辽市周边出生1周龄的西门塔尔犊牛5头健康犊牛和20头腹泻犊牛，将20头腹泻犊牛随机分成4组，各组每天分别饲喂0、2、4、6 L初乳，对照组每天饲喂初乳2 L，连续饲喂7 d。结果表明，与其他3个试验组相比，初乳中剂量组可降低TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ、MPO和CD8+T的水平，同时提高IL-2、TGFβ2、CD4+T、CD3+T和CD19+B的水平以及增加犊牛体温、体重和减少排粪便时间，说明初乳具有抗炎的作用。在直肠中，初乳可降低大肠杆菌的数量，增加脆弱杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌的数量。研究发现，饲喂4 L初乳提高腹泻犊牛抗炎的能力，有效的调节肠道菌群的失调，有利于犊牛的机体健康。

　　关键词：初乳；腹泻；犊牛；免疫；肠道菌群

　　0引言

　　在畜牧生产过程中，商品化肉牛的养殖模式加大，喂养犊牛初乳的时间相对较短，导致犊牛腹泻的发病率增加。犊牛腹泻在畜牧生产上较为常见，多发于断奶前的新生犊牛，犊牛发病时主要表现为消化不良和腹泻，这对规模化的畜牧生产造成严重的影响。因此，促进养殖生产发展要解决犊牛腹泻问题。初乳是母牛在生产1周之内分泌的乳汁，其中含有蛋白质、氨基酸、脂肪等丰富的营养物质，营养物质可以健全新生犊牛胃肠道功能和提高机体的免疫力，是新生犊牛重要的营养来源。初乳可以提高成活率，有效方法是在犊牛出生的24 h内尽早喂足初乳，营养物质通过血液运送到犊牛肠道中来保护犊牛免受病原的侵害。新生犊牛肠道微生物的丰富度随着日龄的增加而逐渐提高，肠道菌群受到干扰破坏可能导致腹泻的发生，因此维护健康的肠道菌群既可以保护宿主的健康，又能预防和治疗腹泻。为探究初乳饲喂剂量对新生犊牛腹泻的影响，分析不同饲喂剂量的初乳对新生犊牛的行为、体重、血清中的免疫因子、外周血淋巴细胞亚群及直肠粪便微生物群落影响的试验结果，研究初乳饲喂剂量对新生犊牛腹泻发病率及抗病能力的影响，以期为犊牛腹泻的预防提供参考。

　　1材料与方法

　　1.1试验动物

　　选择通辽市周边出生1周龄的西门塔尔犊牛5头健康犊牛和20头腹泻犊牛，根据威斯康星大学麦迪逊分校腹泻评分标准对犊牛进行评分。健康犊牛：粪便成型、质地良好=0分，半成型、粪便稀软=1分。腹泻犊牛：粪便稀软不成型=2分，粪便完全成液体状=3分。犊牛体重为（40±10）kg/头。

　　1.2试验设计及饲养管理

　　5头健康犊牛为空白对照组（CO组），20头腹泻犊牛分成4个组：初乳低剂量组（A组）、初乳中剂量组（B组）、初乳高剂量组（C组）和腹泻组（D组），见表1，并标记对应的母牛。犊牛在出生2 h内灌喂1 L初乳。第2天开始，每天2次喂养2 L其他母牛挤下的初乳和常乳，并饮温水。第7天开始，除了初乳，每次投喂2.5 kg开口采食料，犊牛自由采食并饮温水。

　　1.3主要试剂及仪器

　　细菌基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶等试剂盒和Premix Taq TM购于天根公司（中国）；基因引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司，荧光定量PCR试剂盒购自宝日医生物技术（北京）有限公司；ELISA试剂盒购自宝日医生物技术（北京）有限公司。荧光定量PCR仪、酶标仪和流式细胞仪（Thermo Scientific公司）。

　　1.4样品的采集

　　初乳的采集：每天4:00使用小型挤奶车对经产母牛进行初乳的收集，巴氏灭菌后收集到瓶子中并做好标记。血液的采集及血清提取：试验的第7天晚上饲喂结束2 h后5 mL采尾静脉血，2 000 r/min离心1 min分离血清，分装后放在-20℃冰箱保存。直肠粪便的采集：试验结束前采集直肠粪便，采集后放在液氮罐中保存。

　　1.5指标的测定

　　1.5.1行为、体温和体重的测定

　　在试验期间，每天早晚进入牛舍，利用计时器人工进行观察记录犊牛1 h内的排粪时间和卧息时间，计算试验7 d 20 min内的排粪时间和卧息时间。定栏饲喂犊牛时，测量人员使用体温计测量直肠温度；使用红外线皮温枪测量皮温，计算7 d平均温度。温度计算方法参考韩波的方法。试验第1天饲喂之前和第7天试验结束，使用电子秤测量试验初体重与试验末体重，计算增重。

　　1.5.2血清中免疫因子的检测

　　在试验第7天时，利用ELISA试剂盒检测血清样品中肿瘤坏死因子-α（TNF-α)、白细胞介素-1β（IL-1β)、白细胞介素-6（IL-6）、转化生长因子β2（TGFβ2）、白细胞介素-2（IL-2）、γ干扰素（IFN-γ)、髓过氧化物酶（MPO）、免疫球蛋白G（IgG）的含量。

　　1.5.3外周血淋巴细胞亚群测定

　　试验第7天，分别对犊牛颈静脉采血200μL，加10倍稀释的溶血素2 mL，静置离心；弃上清，反复洗涤3次；对沉淀加150μL磷酸盐缓冲液（PBS）稀释成1×106个/μL；分成3份，每份50μL，加入10μL的荧光标记抗体CD4＋T-PE/CD8＋T-FITC、CD3＋T-PE/CD19＋B-FITC，置于4℃冰箱孵育30 min，加2 mL PBS，1 200 r/min离心10 min，弃上清；沉淀中加200μL PBS悬浮振荡，流式细胞仪检测CD4+T、CD8+T、CD3+T和CD19+B细胞所占百分数。

　　1.5.4直肠粪便的细菌群落检测

　　设计特异性引物详情见表2。将采集粪便样品分离纯化培养细菌，利用细菌提取RNA试剂盒提取RNA，反转录后进行荧光定量PCR试验，对直肠粪便中存在的双歧杆菌、大肠杆菌、乳酸杆菌与脆弱杆菌的数量进行分析。

　　1.6数据与分析

　　所有试验数据均用Excel 2010进行初步处理，在SAS 9.0软件中的ANOVA进行方差分析。试验数据采用“平均值±标准差”的形式来表示，P＜0.05为差异显著，P＞0.05为无显著性差异。

　　2结果

　　2.1初乳对腹泻犊牛行为、体温和体重的影响

　　D组中在20 min内排粪便和卧息时间高于其他各组。A组的平均体温和直肠温度低于CO组、B和C组。从试验结束后的犊牛体重结果来看，D组的增重显著低于其他各组（P＜0.05），见表3。

　　2.2初乳对犊牛血清中免疫因子的影响

　　CO组犊牛血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的浓度显著低于D组（P＜0.05），D组血清中TNF-α和IFN-γ的浓度显著高于B组。B组血清中TGFβ2的浓度显著高于其他各组（P＜0.05）。B组中IL-2的浓度显著高于CO组、A组和D组，而CO组和B和C组中MPO浓度显著低于A组和D组（P＜0.05）。A组、C组和D组中IgG的浓度显著低于CO组和B组（P＜0.05），见表4。

　　2.3初乳对犊牛外周血淋巴细胞及其亚群的影响

　　B组和C组中CD4+T的水平显著高于CO组和D组（P＜0.05）；B组中CD8+T的水平低于其他各组。CO组的CD4+T/CD8+T的比值高于A组，同时A组中CD4+T/CD8+T的比值低于其他各组。D组中CD3+T的水平显著低于CO、A、B组和C组，B组中CD3+T的水平显著高于其他各组（P＜0.05）。B组中CD19+B的水平显著高于D组（P＜0.05），见表5。

　　2.4初乳对腹泻犊牛直肠粪便菌群的影响

　　D组中大肠杆菌的数量显著高于CO、A、B组和C组（P＜0.05）。D组中脆弱杆菌的数量显著低于其他各组，B组中脆弱杆菌的数量显著高于其他各组（P＜0.05）。D组中乳酸杆菌和双歧杆菌的数量低于其他各组，见表6。

　　3讨论

　　初乳有益于犊牛的生长发育和健康，一方面提高犊牛的成活率，另一方面提升犊牛的生长性能。王炳科等研究发现新生犊牛在出生后及时饲喂初乳，可以大大降低犊牛腹泻的发生率。犊牛在出生时，不具有发育完全的免疫系统，需要从初乳中获得免疫物质来完善自身的免疫系统。在犊牛出生的早期肠道微生物的形成离不开初乳的喂养，初乳中含有丰富的生长剂和抗微生物因子。此外，Ishaq S L等提出犊牛出生后要尽早饲喂初乳，有利于肠道微生物多样性的形成。

　　本研究结果表明，初乳的饲喂能一定程度上提高犊牛的体重，具有维持腹泻犊牛的体温的作用；提高血清IL-2和IgG的含量，增强犊牛的对外界变化的防御能力和自身的免疫功能，并且可以改善犊牛的健康。本试验发现初乳中剂量为最佳饲喂剂量，初乳中剂量组中CD3+T和CD19+B的水平高于其他各组，并且犊牛的脆弱杆菌数量显著高于其他各组。

　　防治新生犊牛腹泻病，既要及时饲喂好初乳，又要加强饲养管理，保持畜舍环境的清洁度和舒适度，保证犊牛的初乳供应和科学的日粮配比。同时，还可在犊牛生命早期饲喂添加益生菌，改善犊牛胃肠道的健康来提高饲料的转化率。目前，初乳对新生犊牛所产生的被动免疫机制还有待各专家学者进行深入研究，以便更好地防控犊牛腹泻病的发生。

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