摘要：探究运用恒温扩增法（Loop—mediated isothermal amplification，LAMP）在感染人群病原体诊断方面的价值。收集2022年1-8月255名下呼吸道感染患者的痰液或肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid，BALF），运用LAMP法和痰培养法同时对其进行检测，分析病原体检出情况、恒温扩增芯片法与痰培养法符合率。运用LAMP法检出阳性标本200例，总阳性率为78.43%，共检出呼吸道病原体10种；运用痰培养法检测出阳性标本80例，总阳性率为31.37%，共检出呼吸道病原体8种。两种方法检出的铜绿假单胞菌的阳性率具有高度一致性（Kappa=0.516），鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌的阳性率具有中等一致性（0.4<Kappa<0.6）。恒温扩增法的病原体检出率显著高于传统痰培养法；相较于金标准痰培养法，其对苛养菌的检测具有较好的一致性。但LAMP法检测时间更短、总阳性率更高，更有助于临床医生快速精准地识别所感染的病原体。

　　关键词：下呼吸道感染；恒温扩增法；痰培养；病原体

　　呼吸道感染分为上呼吸道感染和下呼吸道感染。下呼吸道感染多为细菌、病毒、真菌、非典型病原体、结核杆菌复合群等病菌感染[1]，与下呼吸道感染相关的重要病原体包括肺炎支原体、肺炎链球菌以及其他常见病原体，如流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、肺炎衣原体和金黄色葡萄球菌[2]。肺炎链球菌和流感嗜血杆菌都是营养需求极高的苛养菌[3]，其标本采集与接种时间不应超过30 min，因此其培养阳性率很低。肺炎支原体只能通过检测IgM抗体来判断，IgM抗体通常可以在病原体感染一周左右被检测到[4]，这对早期诊断和早期临床指导药物的选择造成了限制。WHO 2020年的最新统计数据显示，发达国家下呼吸道感染的死亡率居于第六[5]。分析LAMP技术在下呼吸道感染病原体诊断方面的表现，以期提高病原菌诊断的精准性，为医生选择抗菌药物提供更准确的指导。

　　1材料与方法

　　1.1一般资料

　　本研究选择2022年1-8月在我院接受治疗的255例下呼吸道感染患者开展研究。其中男性177例（69.4%），女性78例（30.6%）。患者年龄为4-83岁，平均年龄62.25岁。纳入标准：①以2016年版《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南》[6]和2019年版《儿童社区获得性肺炎诊疗规范》为标准[7]，确定对患者的诊断是否符合标准；②接受同时进行LAMP法及痰培养法病原学检测；③入院前未使用免疫抑制剂。排除标准：①不满足2016年版《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南》和2019年版《儿童社区获得性肺炎诊疗规范》要求的患者；②有其他基础疾病，长期使用激素及其他免疫抑制剂的患者；③不能配合进行样本采集者。

　　1.2研究方法

　　痰培养法：在巧克力色血琼脂平板、血琼脂平板和麦康凯琼脂平板上分别接种适量痰样本或BALF，将其放入5%~10%的二氧化碳培养箱，于35℃培养24 h或48 h，观察培养结果，筛选出可能的致病菌。

　　恒温扩增法：采用微流控芯片、热稳定聚合酶以及先进的恒温扩增技术，将反应置于65℃的稳定环境中，以实现链置换效果。通过使用荧光染料，对阳性样品进行荧光检测。通过核酸分析仪对样品进行分析，该分析仪可同时检测13种下呼吸道感染的常见病原体。

　　1.3仪器与试剂

　　核酸检测试剂和RTisochipTM-A热稳定扩增芯片分析仪，由博奥生物集团有限公司生产；II级B2型生物安全柜，由苏洁医疗器械（苏州）有限公司生产；干式恒温加热器，由杭州奥盛仪器有限公司生产；病原体培养鉴定所用的血琼脂平板、巧克力色血琼脂平板、麦康凯琼脂平板，由郑州安图生物工程股份有限公司生产；细菌鉴定仪，由珠海迪尔生物工程股份有限公司生产；二氧化碳培养箱，由日本三洋公司生产。

　　1.4统计学处理

　　用SPSS 24.0统计软件对数据进行分析处理。两组间的临床资料比较用百分比和例数表示，用X2检验。若X2检验的显著性小于0.05，则说明存在显著性差异。计算Kappa值以评估其一致性。

　　2结果

　　2.1两种检测方法的检测结果

　　在255份痰样本中，LAMP法在200例样本中检出了呼吸道病原体，总阳性率为78.43%；痰培养法在80例样本中检测到了呼吸道病原体，总阳性率为31.37%。LAMP法的总阳性率明显高于痰培养法（P<0.05），表明二者的差异具有统计学意义（表1）。LAMP法鉴定出的主要病原体为耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌，其次是流感嗜血杆菌与肺炎克雷伯菌。痰培养法检测到的主要病原体为肺炎克雷伯菌，其次是鲍曼不动杆菌与铜绿假单胞菌（图1）。肺炎支原体检测出了8例IgM阳性，阳性率3.14%，肺炎衣原体未检出；LAMP法检测出肺炎支原体9例，阳性率3.53%，同样未检出肺炎衣原体，两种方法对肺炎支原体的检测无统计学差异（P<0.05）（表2）。但通过对比检测时间，发现LAMP法较血清学和痰培养法检测时间更短（表3）。

　　2.2两种方法病原体检测结果的一致性分析

　　分析LAMP法和痰培养法对病原体检测结果的一致性（表4）。结果显示，二者对于铜绿假单胞菌的检测具有高度一致性（Kappa=0.516），对于肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌的检测具有中等一致性（0.4≤kappa<0.6），对于金黄色葡萄球菌、嗜麦芽窄食单肥功、肺炎链球菌和流感嗜血样菌检测的一致性良好（0.2≤kappa<0.4）。虽然对大肠埃希氏菌检测的一致性较差，但LAMP法比痰培养法的检出阳性率高，差异具有统计学意义（P<0.05）。除嗜麦芽窄食单胞菌，两种方法对其他病原体的检测结果的差异均具有统计学意义（P<0.001）。

　　3讨论

　　下呼吸道感染是临床较为常见的一种多发性疾病，对人类生命健康造成了严重的威胁。研究表明，下呼吸道感染的成年人死亡率约为3%～5%[8]，若治疗不及时可发展为重症，重症死亡率达30%~50%[9-10]。根据File等[11]的研究，北美平均每年在治疗社区获得性肺炎方面的支出高达170亿美元。肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、结核分支杆菌复合群等属于苛养菌[12]，营养要求高，一般从送检到接种的时间不能超过30 min[13]。嗜肺军团菌是一种细胞内寄生细菌[14]，传统细菌培养法所需的培养鉴定周期长、操作繁琐，进行细菌培养可能会延误对疾病的诊断[15]。LAMP法可以在很短的时间内（约2 h）完成对多种呼吸道病原体的检测，可同时检测出12种病原体和1种耐甲氧西林葡萄球菌耐药基因（mecA基因）[16]。

　　在本次研究中，LAMP法检测出了200份阳性标本，总阳性率达78.43%；而传统培养法检出的阳性率仅为31.37%。通过对我院下呼吸道病原体分布的统计分析，发现在200份阳性标本中，金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和流感嗜血杆菌的检出率最高。

　　本研究利用LAMP法对下呼吸道感染患者的标本进行检测，通过对13种病原体的检测，我们发现，肺炎克雷伯杆菌是造成下呼吸道感染的主要原因，其次为耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌及鲍曼不动杆菌。经过分析，本次研究结果与我院当年呼吸道标本分离细菌的分布情况基本一致，但与当年全国细菌耐药监测网发布的数据存在一定的出入，这可能是由地域差异导致的。采集和运输方式不当会对培养阳性率产生较大影响[17]。

　　本文的主要局限在于样本量较小且仅来自单个医院，仅包括255名患者，研究结果可能无法代表更大的人群或适用于不同的医疗环境。未来的研究应采用更大的样本量、多中心设计、综合纳入标准并与金标准测试比较，以克服上述局限性并提供可靠和适用性更强的研究结果。另外在细菌培养过程中，还发现了雷式普罗威登菌、烟曲霉、屎肠球菌、产气克雷伯菌、曲霉菌5种病原体，尽管LAMP十三项联检可以检测出13种常见病原体，但它仍存在局限性，仍无法完全覆盖全部病原体。通过细菌培养，我们可以确定菌株是否耐药，但LAMP十三联检只能鉴定菌种，无法确定耐药基因[18]。

　　总而言之，与常规痰培养法相比，恒温扩增检测法可以在短时间内检测出引发感染的病原体，检测时间短，阳性率高，有助于医生在短时间内精准判断引发下呼吸道感染的病原微生物，从而有针对性地使用抗生素进行治疗。

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