摘要：文章以脂多糖（LPS）为致病因子，通过刺激人牙周膜成纤维细胞（hPDLFs）建立模型，研究胶原蛋白肽（CP）对口腔的保护作用及其可能机制。结果表明，100 mg/mL以上质量浓度的CP能有效降低LPS对hPLDFs的毒性，显著提高hPLDFs的增殖能力，同时也能有效降低TLR4和NF-κB的表达量，对炎症因子的分泌产生明显的影响。作用机理可能是，CP作为一种信号分子作用于TLR4，通过抑制TLR4和NF-κB的表达来抑制LPS引起的炎症反应，从而促进hPDLFs增殖。

　　关键词：口腔修护；牙周膜成纤维细胞；胶原蛋白肽；炎症因子

　　牙周炎是口腔科中的常见病和多发病，在世界范围内有较高的患病率。牙周膜成纤维细胞（PDLFs）作为牙周膜中分布最多、功能最重要的细胞[1]，一直是影响牙周炎发病机制、护理预防和修复治疗的重点，调控PDLFs的凋亡及炎症因子的分泌对防治牙周炎病症具有十分重要的意义。

　　胶原蛋白肽（Collagen Peptides，CP）作为一种天然的生物产品和功能性蛋白配料，近年来在食品、化妆品和药品等多个领域的应用发展迅速，但关于其在口腔修护方面的应用研究相对较少。牙周炎的主要致病菌是革兰氏阴性厌氧杆菌，其外膜成分脂多糖（LPS）被认为是破坏牙周的主要毒力因子之一[2]。本研究通过LPS干预诱发炎症反应来建立体外PDLFs炎症模型，并从细胞水平来深入研究胶原蛋白肽（CP）对PDLFs的细胞活力和炎症因子分泌的影响，以期为胶原蛋白肽的临床应用提供可靠的实验依据。

　　1实验材料及仪器

　　1.1材料

　　胶原蛋白肽（Collagen Peptides，CP）来自北京盛美诺生物技术公司。

　　1.2仪器和设备

　　电泳仪为Bio-RAD；Multiskan MK3酶标仪为Thermo Scientific。

　　2实验方法

　　2.1 CCK-8（Cell Counting Kit-8）法测定细胞活力

　　取冻存人牙周膜成纤维细胞（hPDLFs），复温培养后，取对数生长期细胞，0.25%的胰酶消化后用含10%FBS的DMEM培养基制备成1×105个/mL的细胞悬液，备用。

　　取细胞悬液，每孔100μL均匀接种于96孔板中，置于培养箱中培养24 h。按实验分组加入培养基，培养24 h后，每孔内加入10μL的CCK-8，避光反应2 h，酶标仪上测定各孔在450 nm处的吸光值（A）。

　　相对增殖率的计算公式如下：

　　2.2实验分组

　　经CCK-8法筛选，确定LPS质量浓度为10.0μg/mL时，对细胞生长具有较强的抑制作用且无明显的毒性。

　　将hPDLFs细胞分为空白对照组、模型组、CP-10组（10 mg/L CP）、CP-50组（50 mg/L CP）、CP-100组（100 mg/L CP）、CP-500组（500 mg/L CP）和CP-1000组（1000 mg/L CP）。其中，空白对照组采用正常的DMEM培养基培养，模型组采用含10μg/mL LPS的DMEM培养基培养，不同质量浓度的CP组采用含10μg/L LPS及相应质量浓度的CP的DMEM培养基培养。

　　2.3酶联免疫吸附法检测炎症因子

　　取细胞悬液接种于孔板中，加入相应的培养基，培养24 h后收集细胞上清，检测炎症因子。

　　2.4 Western Blotting检测蛋白质表达

　　取细胞悬液接种于6孔板中，加入相应的培养基，培养24 h后收集细胞，提取总蛋白并定量。随后，进行电泳转膜，分别加入TLR4、NF-κB p65、iNOS和GAPDH蛋白一抗，在4℃条件下孵育过夜，TBST洗涤后，加入二抗室温下孵育1 h，TBST洗涤后使用ECL发光液曝光，观察蛋白条带。

　　2.5统计方法

　　数据采用SPSS 23.0软件进行统计数据处理，各组实验数据以均数±标准差表示，P<0.05呈显著性差异，具有统计学意义。

　　3结果及分析

　　3.1 CP对hPDLFs细胞活性的影响

　　应用CCK-8法检测不同质量浓度的CP对正常hPDLFs细胞活力的影响。可以看出，在1~5 d内，不同质量浓度的CP对hPDLFs的细胞活力均有一定的促进作用，且时间越长效果越显著。在5组不同质量浓度的实验中，质量浓度为100 mg/L的CP的作用最显著。

　　3.2 CP对LPS处理条件下hPDLFs细胞活力的影响

　　CP对细胞活力的影响见图1。可以看出，与空白对照组相比，模型组的细胞活力显著降低，说明10μg/L LPS具有显著的抑制作用，CP-10组与模型组的细胞活力相近，CP-50、CP-100、CP-500和CP-1000效果组的细胞活力较模型组显著升高。

　　3.3 CP对LPS处理条件下炎症因子分泌的影响

　　TNF-α、IL-8、IL-6是参与炎症反应的重要介质，可促进炎性反应进程。CP对炎症因子分泌的影响见图2。可以看出，LPS刺激24 h后，模型组IL-8和TNF-α的分泌量分别是空白对照组的5倍和4倍左右；IL-6的分泌量为空白对照组的1/3左右。这一结果说明，LPS能显著上调hPDLFs中IL-8和TNF-α的分泌量，且显著降低IL-6的分泌量。除CP-10组外，其他实验组中的IL-8和TNF-α含量较模型组均显著降低，IL-6含量均显著升高。

　　3.4 CP对LPS处理条件下hPDLFs待测蛋白表达的影响

　　CP对待测蛋白的表达情况见图3。

　　研究结果显示，与空白对照组相比，模型组中的TLR4和NF-κB p65含量显著增加，而iNOS含量显著降低。实验说明，高于100 mg/L的CP对LPS的毒性具有显著的抵消作用。

　　4讨论

　　PDLFs作为牙周膜中最主要的细胞，是牙周组织再生和修复损伤的细胞基础。本研究结果显示，100 mg/mL以上质量浓度的胶原蛋白肽（CP）不仅能促进hPDLFs生长，还能降低LPS对hPDLFs的细胞毒性，提升细胞活力和迁移能力。这与刘超等[3]的研究结果一致，说明CP具有潜在的口腔修护功效。此外，推测CP具有信号分子的作用，能加速PDLFs的代谢活动，从而提高细胞活力和迁移能力。

　　脂多糖（LPS）是细菌表面最重要的致病因子，能刺激多种类型的细胞分泌细胞因子。本研究利用LPS刺激hPDLFs，模拟建立了体外牙周炎感染模型。研究发现，10μg/mL LPS会诱导hPDLFs增加IL-8和TNF-α的分泌，但会减少IL-6的分泌。IL-6和TNF-α都属于促炎因子，其中IL-6是由LPS诱导产生的重要炎症因子之一，能产生复杂的促炎和抗炎双向作用。有研究表明[4]，成纤维细胞可以自发产生IL-6，LPS可通过抑制IL-6细胞因子的表达来逃避宿主的免疫防御机制。本实验结果显示，正常的hPDLFs同样会自发分泌少量的IL-6由此，可推测IL-6是作为一种基础防御因子而存在于hPDLFs内的，而LPS会降低IL-6的分泌，从而有助于LPS在更长时间内存在。

　　TNF-α作为炎症细胞因子可促进IL-1、IL-6、IL-8等的表达。本研究中，较空白对照组而言，模型组中TNF-α的蛋白表达水平显著增加，添加CP后，TNF-α显著降低，表明CP能通过减少TNF-α的产生而减弱炎症反应。IL-8是导致牙周炎症的另一种重要的促炎因子和免疫调节因子。本研究结果显示，100 mg/mL以上质量浓度的CP能显著减少LPS诱导hPDLFs产生的IL-8。

　　TLR4是细胞识别LPS的重要分子，LPS能够通过刺激TLR4表达发挥毒性作用。NF-κB是炎症反应中重要的信号通路，可调控多种炎症因子的转录与表达。本研究表明，LPS会促进hPDLFs中TLR4和NF-κB p56的表达水平，而100 mg/mL以上的CP能显著降低两者的表达，说明CP对LPS诱导产生的hPDLFs细胞炎症有一定保护的作用。其作用机制可能是该成分参与调控TLR4/NF-κB通路，抑制下游炎性细胞因子TNF-α和IL-8的表达，以起到保护hPDLFs的作用。

　　有效的口腔护理能够预防或降低牙周炎等口腔炎症的发生。然而，目前的口腔护理仍以药物治疗方式为主，而药物虽能够有效控制炎症，但长期使用会引发严重的不良反应。因此，迫切需要探索低毒甚至无毒的抗炎成分。本研究显示，胶原蛋白肽（CP）可减弱LPS诱导下hPDLFs细胞活力，抑制炎症反应，为其在牙周疾病的预防和治疗中的应用提供了有力的证据。

　　参考文献

　　［1］SOKOS D,EVERTS V,VRIES T J.Role of periodontal ligament fibroblasts in osteoclastogenesis:a review［J］.Journal of periodontal research,2015,50(2):152-159.

　　［2］Nemoto E,Darveau R,Foster B,et al.Regulation of Cementoblast Function by P.gingivalis Lipopolysaccharide via TLR2［J］.Journal of Dental Research,2006,85(8):733-738.

　　［3］刘超,孙皎.水解罗非鱼胶原促进人牙周膜细胞活力及成骨分化的效应［J］.口腔材料器械杂志,2017,26(2):74-78.

　　［4］滕嘉硕,李梦思,罗远良,等.心脏成纤维细胞释放的IL-6在阿霉素致SD乳鼠心肌细胞损伤中的作用研究［J］.中国病理生理杂志,2021,37(6):1004-1010.