摘要：灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）是导致果蔬腐败的主要病原菌之一。乳酸菌因为安全、无毒且具有一定的抗菌作用，在抑制果蔬腐败病原菌方面具有一定的潜在价值。鉴于此，文章期望从发酵食品和常见水果表面分离并筛选出抑制灰葡萄孢菌活性的乳酸菌，结果发现有10株乳酸菌对灰葡萄孢具有抑菌活性。经鉴定，3株（JZ a1、MJ a2、PS b1）为Limosilactobacillus fermentum，2株（ZLJ、MDF b)为Lactobacillus pentosus，MHT b为Lactobacillus acidophilus，4株（SCb1、MJ a、MDF a、MHT a1）还有待进一步鉴定。文章为开发果蔬生物保鲜剂提供了实践基础与理论支撑。

　　关键词：果蔬腐败菌；乳酸菌；灰葡萄孢菌；拮抗

　　灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）是导致果蔬腐败的主要病原菌之一。研究发现，贮藏期间，微生物污染引起的腐败变质是果蔬保鲜质量的主要影响因素[1]。冯丽等[2]通过菌种分离、形态学和分子生物学鉴定、致病性实验等方式明确了导致贵长猕猴桃腐败的病原菌种类及可能的侵染途径。龙明秀等[3]采用菌丝生长速率测定法考察固载ClO2保鲜剂对最强致病力菌株的抑菌效果。

　　乳酸菌是一类能够发酵糖类物质，产生乳酸的细菌。这类细菌广泛分布于自然界，在工农、食品与医药等领域具有较高的应用价值[4]。乳酸菌因其丰富的生物活性而被广泛用作食品的生物保鲜剂或发酵剂，并能够对抗食品中的致病菌和腐败菌[5]。

　　本研究的目的在于，通过体外拮抗实验筛选出对果蔬腐败菌——灰葡萄孢菌的活性具有良好抑制作用的乳酸菌菌株，并结合菌株形态特征观察和分子生物学方法进行鉴定，为研究果蔬的腐烂机制和生物保鲜方法提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1实验材料

　　1.1.1菌株来源

　　（1）乳酸菌分离菌株：从贵州多种传统发酵食品如酸菜汁、泡菜、糟辣椒、水果、米酒等中分离筛选出乳酸菌菌株，供后续研究使用。

　　（2）菌株：灰葡萄孢HYCC3731，购于微生物菌种保藏中心。

　　1.1.2试剂与培养基

　　MRS琼脂、MRS肉汤培养基、PDA培养基、PDB培养基，上海博微生物科技有限公司。

　　1.1.3仪器设备

　　电热恒温培养箱DH6000BII，天津市泰斯特仪器有限公司；洁净工作台SW-CJ-2FD，苏州安泰空气技术有限公司；生物显微镜Motic BA200，重庆奥普光电技术有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅LDZX-50KE，上海申安医疗器械厂。

　　1.2实验方法

　　1.2.1优质乳酸菌菌株的筛选及分离纯化

　　分别取酸菜汁、糟辣椒、酒糟、米酒、泡蒜、霉豆腐、猕猴桃等样品，进行适当的梯度稀释后，取100μL在MRS琼脂培养基平板上涂布均匀，37℃培养48 h后，分离纯化获得乳酸菌，并编号为SC b1、ZLJ、JZ a1、JZ b、MJ a、MJ b、PS b1、MDF a、MDF b、MHT a1、MHT b。

　　1.2.2乳酸菌保藏

　　将分离纯化后得到的菌株接种于MRS液体培养基中连续培养3代后，在菌液加入混有30%甘油的MRS肉汤培养基，将菌液震荡均匀，放入-80℃的冰箱中冷冻保存。

　　1.2.3腐败菌的活化

　　从微生物储存中心购买灰葡萄孢HYCC3731菌株，挑取适量菌体放置于PDA琼脂表面，放于真菌培养箱中，28℃培养48 h，再从活化的PDA琼脂培养基中挑取适量菌体接入PDB肉汤培养基中活化2-3代，即可使用。

　　1.3腐败菌形态观察

　　从微生物储存中心购得灰葡萄孢HYCC3731菌株，放于真菌培养箱中，48 h后长出灰葡萄孢小型丝状真菌，菌落明显，呈灰白色，菌丝密集旺盛，向平板边缘蔓延生长。如图1所示。

　　1.4拮抗腐败菌乳酸菌菌株的初步筛选

　　利用平板对峙法，将腐败菌菌液接种于PDA培养基中，涂布均匀，用无菌镊子夹取高压灭菌后的牛津杯置于培养基上，每个牛津杯中加不同的溶液。将平板放于真菌培养箱中培养，观察抑菌圈，对具有抑菌活性的菌株进行二次复筛。

　　1.5针对腐败菌拮抗的乳酸菌菌株的复筛

　　对已经筛选出的抑菌效果较好的菌株进行复筛，复筛实验操作与初筛实验相同，观察有无抑菌圈并与初筛得到的抑菌圈进行比较，得到抑菌效果好且稳定的菌株。

　　1.6获得菌株16s rRNA序列同源性分析

　　将分离筛选出的菌株寄至上海派森诺生物科技有限公司进行测序，进行16S rRNA序列同源性分析。

　　2结果与分析

　　2.1拮抗灰葡萄孢乳酸菌的筛选

　　实验采用牛津杯法测定50株分离株对腐败菌的抑菌活性，其中10株乳酸菌（MJ a、MJ a2、MHT a1、JZ a1、MHT b、PS b1、MDF a、MDF b、SC b1、ZLJ）对灰葡萄孢具有较好的抑菌活性，其抑菌圈直径均为6~25 mm。对筛选出的具有抑菌活性的10株乳酸菌进行复筛，其抑菌活性如表1所示，抑菌圈直径为6~23 mm。

　　2.2获得菌株的菌落与菌体形态观察

　　将获得的菌株经3代纯化，观察到菌落的形态大小基本一致后，挑取单菌落到载玻片上进行染色，在光学显微镜下观察其菌体形态和颜色。本实验共分离出了50株乳酸菌菌株，初步筛选出对腐败菌抑制效果较好的10株菌株，对这10株菌株进行进一步研究。这10株菌株的菌落和菌体形态如图2所示。

　　2.3具有抑菌活性菌株的分子生物学鉴定

　　对菌株进行16S rRNA序列测序鉴定，将测序结果在BLAST上与数据库中已知细菌的16S rRNA序列进行对比，选取相似度大于99%的同源序列加以分析。对灰葡萄孢具有抑菌活性10株乳酸菌中有3株（JZ a1、MJ a2、PS b1）为发酵乳酸杆菌（Limosilactobacillus fermentum），2株（ZLJ、MDF b)为戊糖乳酸杆菌（Lactiplantibacillus pentosus），1株（MHT b）为嗜酸乳杆菌（Companilactobacillus pabuli），4株（SC b1、MJ a、MDF a、MHT a1）有待进一步鉴定。

　　3结论

　　随着人们对食品安全重视程度的加深，对新型生物保鲜剂的研究也在迅速发展。该实验从贵州传统发酵食品（如、泡菜、酸菜汁、米酒等）中分离得到50株乳酸菌菌株，其中10株对灰葡萄孢菌具有较好的抑菌活性，3株（JZ a1、MJ a2、PS b1）为发酵乳酸杆菌（Limosilactobacillus fermentum），2株（ZLJ、MDF b)为戊糖乳酸杆菌（Lactiplantibacillus pentosus），1株（MHT b）为嗜酸乳杆菌（Companilactobacillus pabuli），4株（SC b1、MJ a、MDF a、MHT a1）有待进一步鉴定。此研究结果与王雅等[6]从自然发酵椰子水中分离鉴定得到的一株优良菌株A32为发酵乳杆菌的结果一致；与覃志成等[7]从番茄发酵液中分离鉴定出的3株乳酸杆菌为植物乳杆菌属和乳杆菌属的结果相似。本研究获得了对灰葡萄孢菌具有较强抑菌活性的乳酸菌株，为进一步利用乳酸菌制备猕猴桃等相关果蔬的防腐产品提供了重要的理论依据和实践基础。

　　参考文献

　　［1］王虎玄,代春吉,孙宏民,等.鲜切猕猴桃片冷藏过程中优势腐败细菌的分离鉴定［J］.陕西科技大学学报,2019,37(1):37-42.

　　［2］冯丽,魏洪,黄亚励,等.贵长猕猴桃腐烂菌的侵染途径及分离鉴定［J］.中国酿造,2018,37(2):66-70.

　　［3］龙明秀,王辉,蒋纬,等.固载ClO2保鲜剂对米良猕猴桃腐败菌的抑菌活性［J］.食品工业科技,2016,37(4):342-346.

　　［4］裴家伟,吴荣荣,马静,等.乳酸菌产生的拮抗物质:一类延长食品货架期的生物防腐剂［J］.中国乳品工业,2003(6):17-21.

　　［5］康慎敏,武瑞赟,穆文强,等.乳酸菌拮抗食源性致病菌的研究及应用进展［J］.食品科学,2022,43(1):250-259.

　　［6］王雅,姜海燕,马泽威,等.自然发酵椰子水中拮抗乳酸菌筛选鉴定及抑菌特性［J］.食品研究与开发,2021,42(23):156-162.

　　［7］覃志成,周笑犁,吴承木,等.番茄发酵液中乳酸杆菌的分离鉴定及对模拟胃肠液耐受性研究［J］.食品与生物技术学报,2023,42(8):54-61.