摘要：文章通过构建植物表达载体pSH737-35S-EuCML5，将目的基因转入模式植物烟草，获得转基因植株，并对转EuCML5基因、转空载体和野生型烟草植株同时进行低温（4℃)、高温（42℃)、干旱和高盐四种非生物胁迫处理，以观察烟草植株的表型变化。结果发现，在四种非生物胁迫处理下，转EuCML5基因烟草的存活率均高于野生型和转空载体烟草的存活率；同时，转EuCML5基因烟草的叶片卷曲率均低于野生型和转空载体烟草。可见，过表达EuCML5能增强烟草对低温（4℃)、高温（42℃)、干旱和高盐环境的耐受性。这将为进一步了解植物耐逆分子机制以及利用该基因进行作物抗逆性改良奠定基础。

　　关键词：杜仲；类钙调蛋；遗传转化；非生物胁迫；烟草

　　杜仲，又名思仙，是国家二级保护植物。其树皮具有药用功能，含有苯丙素类等成分，对高血压等疾病具有良好的治疗效果[1]。杜仲常通过环剥的方式来进行采收，但剥皮后，其体内的水盐平衡极易被打破[2]。

　　非生物胁迫会严重影响植物的正常生长发育。植物中的转录因子（TFs）可调节植物的生命活动[3]，并影响目标基因[4]。钙调素结合蛋白转录因子（CAMTA）可影响细胞信号的转导。植物细胞溶质通过引起钙离子质量浓度增加，能够促进信号传导，产生特异细胞反应，减轻植物会受到的潜在伤害。生物体内的钙离子调节蛋白可识别并解读传导信号，从而调节细胞特异性反应。植物中的钙传感器主要有四个基因家族，分别为钙调蛋白（CaMs）、类钙调蛋白（CMLs）、钙调磷酸酶B类蛋白（CBLs）、钙离子依赖型蛋白质激酶（CDPKs）。研究表明，类钙调蛋白（CMLs）具有广泛的生物学功能，能够参与低温、干旱和盐胁迫等各种胁迫响应。

　　本实验探究EuCML5基因在烟草耐逆性方面的功能，以期为该基因家族功能的后续研究和植物抗逆改良提供一定的参考。

　　1材料与方法

　　1.1实验材料

　　本研究以三星烟草为实验材料。pSH737-35S-EuCML5植物表达载体由武汉转导生物实验室有限公司合成。实验中用到的大肠杆菌菌株DH5α,农杆菌菌株LBA4404均由本实验室保存。

　　1.2所用培养基

　　种子萌发培养基：4.43 g/LMS+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂+2 mg/LGA3，pH为5.8。

　　重悬液：4.43 g/LMS+30 g/L蔗糖+100 mg/LAS，pH为5.8。

　　共培培养基：4.43 g/LMS+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂+1 mg/L6-BA+0.1 mg/LNAA，pH为5.8。

　　筛选培养基：4.43 g/LMS+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂+1 mg/L6-BA+0.1 mg/LNAA+100 mg/LKan+100 mg/LTim，pH为5.8。

　　生根培养基：2.215 g/LMS+15 g/L蔗糖+6 g/L琼脂+100 mg/LKan+100 mg/LTim，pH为5.8。

　　YEP培养基（固体）：10 g/L酵母粉+10 g/L蛋白胨+5 g/L氯化钠（15 g/L琼脂），pH为7.2。

　　1.3烟草无菌苗培养

　　将烟草种子用75%酒精表面消毒30 s，用无菌水清洗4次；再用次氯酸钠消毒6 min，用枪头吸取无菌水，反复吸打将种子冲洗干净。将消毒处理后的烟草种子铺于1/2MS固体培养基上，密封好后置于植物培养室进行培养，培养条件为光照14 h/黑暗10 h，光照强度6 000~8 000 Lux，温度25℃±2℃。

　　1.4烟草遗传转化

　　当烟草无菌苗的叶片生长到一定大小时，即可用于叶盘法转化。取农杆菌菌液加入YEP液体培养基中（含Kan+Rif），按照180 r/min进行振荡培养。将培养好的农杆菌菌液分装至50 mL离心管中，以5 000 r/min离心10 min后倒掉上清液，获得菌体沉淀。加入等体积的重悬液，涡旋振荡使菌体充分混匀，OD600值调节至0.6~0.8，完成侵染液。取大小合适的烟草叶片，切成0.5 cm×0.5 cm大小的小叶片，将叶片置于侵染液中进行侵染，时间为6 min。侵染结束后，将叶片紧密铺于共培培养基上，置于培养室中暗培养72 h。暗培结束后，将其转移至筛选培养基上继续培养，诱导形成愈伤组织；待愈伤组织分化出抗性芽后，将其切下置于生根培养基上，进行生根培养。待幼苗生长到与组培瓶高度相同时，进行炼苗，将幼苗根部的培养基洗净后移栽到营养土中继续生长。

　　1.5植物材料处理

　　以移栽后的烟草为胁迫处理对象。选取长势一致的转EuCML5基因、转空载体和野生型烟草植株，并同时对其进行低温、高温、干旱和盐胁迫处理。低温和高温处理是将烟草植株分别放入4℃和42℃的光照培养箱中进行培养。干旱处理是用质量浓度分别为100 mmol/L、200 mmol/L和300 mmol/L的甘露醇溶液采用喷施方式（喷施至烟草叶片呈水珠滴落）对烟草植株进行连续处理。盐处理是用质量浓度分别为100 mmol/L、200 mmol/L和300 mmol/L的NaCl溶液，采用喷施的方式对烟草植株进行连续处理。同时，要及时观察植株表型的变化并拍照，对烟草植株的存活率和叶片卷曲率进行统计分析。

　　2结果与分析

　　2.1转基因烟草植株响应低温胁迫

　　选取长势一致的转EuCML5基因、转空载体和野生型烟草各20株进行低温（4℃)胁迫处理。植株存活率及叶片卷曲率见表1。

　　研究发现，转EuCML5基因烟草植株对低温具有更强的抗性。

　　2.2转基因烟草植株响应高温胁迫

　　选取长势一致的转EuCML5基因、转空载体和野生型烟草各20株进行高温（42℃)胁迫处理，植株存活率和叶片卷曲率见表2。

　　研究发现，转EuCML5基因烟草植株对高温具有更强的抗逆性。

　　2.3转基因烟草植株响应干旱胁迫

　　选取长势一致的转EuCML5基因、转空载体和野生型烟草各20株，分别用质量浓度为100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L的甘露醇溶液进行喷施处理。植株存活率、叶片卷曲率见表3。

　　研究发现，转EuCML5基因烟草的叶片卷曲率虽然也有所上升，但上升幅度比野生型和转空载体烟草小很多。这表明，与野生型烟草和转空载体烟草相比，转EuCML5基因烟草植株对干旱的耐受性更强。

　　2.4转基因烟草植株响应高盐胁迫

　　选取长势一致的转EuCML5基因、转空载体和野生型烟草各20株，分别用质量浓度为100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L的NaCl溶液对烟草植株进行喷施处理。植株存活率和叶片卷曲率见表4。

　　研究发现，转EuCML5基因烟草植株比野生型和转空载体烟草植株对非生物胁迫具有更强的耐受性。

　　3讨论

　　钙调素信号转导途径在植物抵抗逆境胁迫中发挥着重要作用。本研究从木本植物杜仲中克隆得到了类钙调蛋白EuCML5基因。结果发现，EuCML5基因在杜仲根中表达较高，茎和叶中表达较低，且能够被非生物胁迫和植物生长调节剂诱导表达。可见，在低温（4℃)、高温（42℃)、干旱和高盐四种非生物胁迫处理下，过表达EuCML5基因能增强烟草对四种非生物胁迫的耐受性，结果与实验室前期结果一致。

　　大量研究发现，CAM家族在植物生长发育、生物和非生物胁迫应答中表现出了非常重要的功能。CAMTA能够控制赋予植物低温耐受性的CBF（C-repeat binding factor）调节因子，提高植物的低温适应性[5]。后续需要通过开展进一步深入研究来阐明EuCML5基因在植物生长发育中的作用机制。

　　4结语

　　本研究采用遗传转化方法将EuCML5基因转入烟草，成功获得了转基因植株，并对转EuCML5基因、转空载体和野生型烟草植株同时进行了四种非生物胁迫处理。研究发现，在胁迫处理下，转EuCML5基因烟草植株的叶片卷曲率的升高幅度小于野生型和转空载体植株；而转EuCML5基因烟草植株的存活率高于转空载体和野生型烟草植株，并随着甘露醇和盐质量浓度的不断升高表现得更明显。可见，过表达EuCML5能增强烟草对低温（4℃)、高温（42℃)、干旱和高盐环境的耐受性。本研究将为对钙调蛋白家族基因功能的深入挖掘和应用以及其抗逆机制的研究提供一定的参考。

　　参考文献

　　［1］王志宏,彭胜,雷明盛,等.杜仲主要生物活性研究进展［J］.天然产物研究与开发,2013,25(9):1302-1309.

　　［2］康传志,王青青,周涛,等.贵州杜仲的生态适宜性区划分析［J］.中药材,2014,37(5):760-766.

　　［3］王娟娟,秦雪梅,高晓霞,等.杜仲化学成分、药理活性和质量控制现状研究进展［J］.中草药,2017,48(15):3228-3237.

　　［4］张小军.杜仲剥皮再生关键技术［J］.农业科技与信息,2018(11):72-73.

　　［5］曾后清,张夏俊,张亚仙,等.植物类钙调素生理功能的研究进展［J］.中国科学:生命科学,2016,46(6):705-715.