摘要：文章通过生产相同的柱高，使用缩小柱直径的方式，利用线性的缩小模型测试了碱液消毒时长及间隔对亲和层析填料（MabCapture重组蛋白A）载量的影响。结果表明，消毒25 h后载量（DBC）仍能达到95%以上；亲和层析消毒间隔为3个循环时，填料的动态结合载量下降5.2%，下降幅度较小，且回收率未出现下降。因此，可将消毒时间定为25 h，并将亲和层析最大消毒间隔定为3个循环。

　　关键词：亲和层析填料；消毒时长；消毒间隔

　　1实验目的

　　随着生物制药行业的快速发展，大规模工业化生产技术逐渐成熟。其中，抗体作为免疫系统的核心组成部分，可预防和控制病原体传播，同时为再次感染提供长期保护。抗体包含2个完全相同的抗原结合片段（Fab）和1个可结晶片段（Fc）。蛋白A能够与抗体的Fc片段结合，用于抗体纯化。

　　亲和层析填料（MabCapture重组蛋白A）的动态结合载量在理论上会受到亲和层析消毒液（0.1M NaOH+1M NaCl）的影响，且与碱液接触时间越长，填料的动态结合载量降低越明显[1]。因此，明确碱液接触时间及填料动态结合载量的降低值，对于了解填料的经济性能有一定参考意义。

　　2实验过程

　　2.1材料（层析设备、介质、主要试剂）

　　AKTA-avant150层析系统；博格隆BXK10/20层析柱；MabCapture重组蛋白A亲和层析介质；NaOH；无水磷酸氢二钠；磷酸二氢钠一水合物；氯化钠；磷酸。按生产工艺要求配制平衡液、再生液、消毒液。疏水层析洗脱峰为笔者所在公司CMAB807产品完成疏水层析的中间产品。

　　2.2方法

　　工业化生产时的层板柱内径为700 mm，柱高为600 mm。实际使用时，装柱高度为18~22 cm。

　　本实验采用与生产相同的柱高，通过缩小柱直径的方式，实现线性的缩小模型，以测试碱液消毒时长及间隔对亲和层析填料（MabCapture重组蛋白A亲和层析介质）载量的影响。计划按实际工艺流程，以博格隆BXK10/20层析柱开展实验，取新的亲和层析填料装填层析柱并测试柱效合格，即建立scale down model。在江苏泰州迈博太科药业有限公司应用AKTA-avant150层析系统开展试验。试验时间为2023年7—9月。

　　2.2.1消毒时长对亲和层析填料（MabCapture重组蛋白A）载量的影响

　　亲和层析柱工艺中装柱高度可接受范围为18-22 cm，线性流速可接受范围为120~160 cm/h。据此，可计算出保留时间范围为6.75~11 min。在亲和层析消毒步骤中，规定消毒液清洗时间不超过15 min，消毒柱体积不少于1.5 CV。假设消毒步骤保留时间为T，消毒柱体积为V，关系式表达如下。

　　V（CV）×T（min）≤15（min）

　　若消毒柱体积取最小值1.5 CV，则消毒保留时间T≤10 min；若以100循环的填料寿命计算，100循环内消毒液与填料接触总时间为100×15=1 500 min，即25 h。本实验将研究消毒液与填料接触0~25 h内填料动态结合载量的变化。

　　在亲和层析载量测试过程中，执行相应步骤的操作数值设置如表1所示。

　　在本项目中，疏水层析洗脱液成分为10 mM PB+200 mM硫酸铵，pH 6.8~7.2，电导率可接受标准为20~40 mS/cm。可见，疏水层析洗脱峰的pH和电导率与疏水层析洗脱液基本一致，且与深层过滤上清接近，适用于亲和层析填料载量的测试。因此，实验使用疏水层析洗脱峰进行亲和层析的动态载量测试。

　　本实验用于载量测试的疏水层析洗脱峰pH为6.75，电导率为38.37 mS/cm，蛋白质量质量浓度为6.3 g/L。

       经过实验，得到填料动态结合载量下降百分比结果如表2所示。

　　结果显示，随着填料与碱液接触时间的增加，DBC呈现下降趋势；在填料与碱液接触时间达到25 h后，DBC为初始值的96.43%，工艺固定生产用载量为DBC的80%。由此可知，累计消毒100次后，仍能满足生产的载量需求。

　　2.2.2消毒间隔对亲和层析填料（MabCapture重组蛋白A）载量的影响

　　亲和层析消毒液中的碱液对亲和层析填料的动态结合载量有损害。若亲和层析在若干个循环后进行1次消毒，且确定若干个循环内不进行消毒以不影响收集液产品的质量，则可显著增加亲和层析填料的使用次数[2]。实验确定，亲和层析在3个循环内不消毒的情况下，对亲和层析的收集液产品质量、回收率和动态结合载量无影响。鉴于深层过滤上清中含有大量杂质，本实验决定采用工艺规程中最高上样载量25 g/L进行上样，并在所挑战的循环间隔数内（3个循环）只进行洗脱和再生，不执行消毒步骤，以比较所挑战的循环数前后填料动态结合载量、层析回收率和收集液产品质量的差别。若在执行挑战的循环后，动态结合载量和回收率未发生降低，且收集液产品质量未发生下降，则说明所挑战的循环间隔数成功[3]。实验次序和实验条件安排如表3所示。

　　本实验用于载量测试的疏水层析洗脱峰样品的pH为6.75，蛋白质质量浓度为6.3 g/L；用于上样的深层过滤上清样品的pH为7.19，蛋白质质量浓度为1.146 g/L。

　　实验过程参数及载量测试结果如表4所示。

　　结果显示，挑战后的层析柱载量测试结果比层析前低5.2%，差距较小，可接受。

　　上样蛋白质质量浓度1.146 g/L，上样体积171 mL，上样蛋白总量196.65 mg。经过第一个循环后，亲和层析洗脱峰蛋白质质量浓度为16.3 g/L,SEC聚体为1.07%，SEC单体为98.76%，收集样品体积为10.36 mL，收集样品蛋白总量为168.87 mg，回收率达85.87%。最后一个循环后，亲和层析洗脱峰蛋白质质量浓度为17.6 g/L，SEC聚体为1.07%，SEC单体为98.74%，收集样品体积为10.32 mL，收集样品蛋白总量为186.91 mg，回收率为95.05%。

　　结果显示，挑战前后的多聚体含量相同，且均满足≤5%的可接受标准；挑战前后样品蛋白回收率未发生下降，且均满足80%~105%的可接受标准。

　　综上可知，在所挑战的3个循环不消毒前后，填料的动态结合载量仅下降5.2%，下降幅度较小，多聚体含量相同，且回收率在挑战后未发生下降，说明在亲和层析3个循环不消毒情况下，填料对目标蛋白的结合能力、填料的纯化能力和回收率未发生明显劣化，可将亲和层析最大消毒间隔定为3个循环。

　　3结论和建议

　　基于亲和层析填料与碱液接触时间对填料动态结合载量有影响，本实验挑战了亲和层析3个循环不消毒试验。结果显示，挑战前后其填料的动态结合载量、收集液的多聚体含量和回收率均未发生明显劣化。因此，可将亲和层析最大消毒循环间隔数定为3，结合循环消毒100次后，其DBC仍能满足生产的载量需求，可大幅提高填料使用次数。然而，在实际生产中，还需关注填料与消毒液的累计接触总时间，并结合载量变化或回收率变化情况定期监控填料动态。

　参考文献

　　［1］郭子豪.高性能蛋白A亲和层析介质的制备、性能与应用研究［D］.无锡:江南大学,2023.

　　［2］张玲,曹小丹,杨海旭,等.连续流层析技术在亲和层析中的应用及生产放大评估［J］.中国生物工程杂志,2021,41(6):38-44.

　　［3］鲁伟,应国清,杨晓明,等.单克隆抗体工业生产中蛋白A亲和层析步骤的成本分析［J］.高校化学工程学报,2023,37(2):276-284.