摘要：文章旨在建立双柏消肿止痛膏的质量控制方法。实验采用薄层色谱法鉴定配方中的当归尾、赤芍，用高效液相色谱法测定配方中黄柏的盐酸小檗碱含量，并采用显微鉴定法鉴定配方中的大黄、黄柏、侧柏叶、红花。研究发现，当归尾、赤芍的薄层色谱法鉴别专属性强，阴性无干扰；大黄的簇晶、黄柏的石细胞、侧柏叶的气孔、红花的花粉粒等显微特征均较为明显；黄柏中的盐酸小檗碱在24.92~299.11 ng（R2=1.000 0）范围内呈良好的线性关系，平均加样回收率为102.3%（n=9），SRSD=2.6%。结果表明，该方法简便、专属性强、重复性好，可作为双柏消肿止痛膏的质量标准。

　　关键词：双柏消肿止痛膏；高效液相色谱；薄层色谱；显微鉴别；盐酸小檗碱；质量标准

　　双柏消肿止痛膏是根据著名中医经验方制成的中药制剂，由大黄、黄柏、赤芍、当归尾、侧柏叶、泽兰、红花、薄荷等药味组成，具有清热解毒、散瘀消肿等功效。为确保临床用药的安全性，本文对该制剂的质量控制方法展开系统性研究，并建立了该制剂配方中当归尾、赤芍的薄层色谱[1-2]鉴别法、大黄、黄柏、侧柏叶、红花的显微鉴别法以及黄柏中盐酸小檗碱的高效液相色谱含量测定法[3]，以有效控制双柏消肿止痛膏的质量。

　　1仪器与材料

　　1.1仪器

　　Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；KQ5200DE型台式数控超声波清洗器；Quintix125D-1CN半微量电子天平（德国赛多利斯公司）；AP-01P真空泵（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；抽滤仪、奥林巴斯CX31生物显微镜；ZF1-I型多功能紫外分析仪。

　　1.2试药

　　色谱级乙腈（批号：20200702）；磷酸二氢钾（批号：20191005）；甲醇（批号：20200915）；盐酸（批号：20201119）；盐酸小檗碱对照品（批号：20200619）；双柏消肿止痛膏（中医院制剂室提供，批号：2021011501、2021011502、2021011503）；双柏消肿止痛膏阴性样品（中医院制剂室提供，缺黄柏的双柏消肿止痛膏）。

　　2显微鉴别

　　取本品置于显微镜下观察。结果显示：大黄中的草酸钙簇晶较为显著，直径为60~140 mm；侧伯叶有明显气孔，呈黄绿色、凹陷型，且其保卫细胞相对较大，侧面观察时形态宛如哑铃；黄柏中含有鲜黄色纤维束，且纤维束周围的细胞中含有草酸钙方晶，共同组成了晶纤维结构，含晶细胞壁木化增厚，还伴有鲜黄色、分枝状的石细胞，同时石细胞壁厚实，具有清晰可见的层纹[4]；红花的花粉粒呈圆球形或椭圆形，直径大约为60μm，具有3个萌发孔。

　　3薄层色谱鉴别

　　3.1当归尾薄层色谱鉴别

　　取本品2贴，除去盖衬，取凝胶膏体25 g，加约150 mL水搅拌均匀，通过挥发油提取装置进行挥发油萃取，并向所得挥发油中加入乙醇直至总体积达到2 mL，确保乙醇充分溶解，以此作为待测样品溶液。另取1 g当归尾作为对照药材，将其置于容器中，加入30 mL乙醚，随后采用超声技术处理30 min，在完成超声处理后，通过过滤操作去除乙醚，并使滤渣中的乙醚完全挥发。向该残渣中加入1 mL乙醇，使其完全溶解，以最终所得溶液作为对照药材溶液备用。依照薄层色谱法（《中国药典》四部通则0502）试验，从对照药材溶液中精确移取3μL，同时从供试品溶液中移取2μL，分别滴加至同一块硅胶G薄层板的指定位置。随后，以正己烷-乙酸乙酯（12∶2）为展开剂，进行薄层色谱的展开操作。待展开完成后，小心取出薄层板并将其置于通风处晾干。最后，将晾干的薄层板置于365 nm波长的紫外光灯下进行观察与检验。从供试品的色谱图（见图1）中可以观察到，对照药材色谱图中的对应位置出现了颜色一致且有相似形状的荧光斑点。

　　3.2赤芍薄层色谱鉴别

　　取本品2贴，除去盖衬，取凝胶膏体25 g，加入乙醚50 mL超声处理30 min。弃去乙醚液，将50 mL乙醇与残渣混合，加热回流1 h后，过滤分离固液并将滤液蒸发干。向干燥的残渣中加入30 mL水进行溶解，同时使用30 mL水饱和的正丁醇溶液提取两次，并将提取液合并。然后，蒸发正丁醇层至干燥。向干燥残渣中加入1 mL甲醇进行溶解，最终得到的溶液即为供试品溶液。另制芍药苷对照品溶液（2 mg/mL乙醇溶液）。依照薄层色谱法（《中国药典》四部通则0502）试验，取3μL对照品溶液与6μL供试品溶液点样于羧甲基纤维素钠黏附的硅胶G薄层板上，采用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）混合液展开。展开后晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液并进行加热处理。最后，供试品的色谱图谱（见图2）的特定位置展现出了与对照药材色谱相匹配的蓝紫色斑点；二者在位置上相互对应且颜色特征一致。

　　4含量测定

　　4.1色谱条件

　　色谱柱：Agilent ZORBAX-SB-C18色谱柱；流动相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（22.5∶77.5)[5]；检测波长：265 nm；柱温：30℃;流速：1.0 mL/min；进样量：5μL；理论板数按盐酸小檗碱峰计≥4 000。

　　在上述实验条件下，盐酸小檗碱与所有其他组分的色谱峰都达到了基线分离标准，且阴性对照溶液未对实验结果造成干扰。

　　4.2对照品溶液制备

　　选取适量盐酸小檗碱对照品，精密称定后，以甲醇为溶剂，配制出每l mL含0.25 mg盐酸小檗碱的贮备液。然后，精密取量1 mL贮备液转移到容量为10 mL的量瓶之中，并加入流动相，直至达到刻度线，进行充分振摇以确保溶液混合均匀。之后，采用孔径为0.45μm的微孔滤膜进行过滤，得到每l mL含25μg盐酸小檗碱的对照品溶液。

　　4.3供试品溶液的制备

　　量取4.0 g去除了盖衬的本品凝胶膏体，进行精密称定，并将其放置于具塞锥形瓶中。然后，精确量取50 mL盐酸-甲醇（1:100）混合溶液加入其中，并在记录重量之后进行30 min的超声波处理。防止冷却，并再次进行称重。接着，利用盐酸-甲醇（1:100）混合溶液将其补充至原重量。从处理完成后的锥形瓶中移取2 mL溶液，并采用流动相将其定容到5 mL，同时使用孔径0.45μm的微孔滤膜进行过滤。最后，取续滤液，得到所需溶液。

　　4.4阴性对照样品溶液的制备

　　按处方比例及工艺制备缺黄柏的阴性样品，再按4.3项下的方法制备阴性对照样品溶液[6]。

　　4.5专属性试验

　　分别吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液5μL，并将其注入高效液相色谱仪，按4.1项下设定的色谱条件进行测定。结果表明，样品与对照品在相同位置有吸收，分离度大于1.5；阴性对照无干扰[7]。对照品、供试品、阴性对照图谱如图3所示。　

　　4.6线性范围考察

　　精密吸取对照品溶液：12.5、25.0、75.0、125.0、175.0、225.0、300.0 ng，根据4.1项下设定的色谱条件进样测定。以进样量为自变量，以峰面积为因变量，进行线性回归分析，得到盐酸小檗碱的回归方程为：y=116.43x-14.141，R2=1.000 0。结果如图4所示，盐酸小檗碱进样量为24.92~299.11 ng，呈良好的线性关系。

　　4.7仪器精密度试验

　　精密吸取对照品溶液5μL，连续重复进样6次，按4.1项下的色谱条件进行测定。结果显示，盐酸小檗碱含量SRSD为0.14%，表明仪器精密度良好。

　　4.8重复性试验

　　取同一批供试品（批号：2021011501）6份，每份约4.0 g，精密称定，按4.3项下的方法制备供试品溶液，并按4.1项下的色谱条件进行测定。结果显示，6份供试品样品中盐酸小檗碱含量的平均值（n=6）为4 078.661 6μg，SRSD=1.05%，表明该方法重复性良好。

　　4.9稳定性试验

　　精密吸取同一供试品溶液（批号：2021011501），分别于第0、2、4、6、7、8 h进行测定。测得盐酸小檗碱峰面积的SRSD=1.0%，表明供试品溶液在8 h内稳定。

　　4.10加样回收率试验

　　称取已知含量的供试品（批号：2021011501）约2 g，精密称定9份，再分别精密量取对照品1、2、3 mg，重复3次加入样品中，按4.3项下的方法制备供试品溶液，分别进样5μL，计算回收率[8]。结果表明，盐酸小檗碱回收率平均值（n=9）为102%，SRSD为2.6%。

　　4.11样品含量测定

　　取6批次的双柏消肿止痛膏，按4.3项下的方法处理并测定，并将每批样品平行测3份，取平均值，以外标法计算含量。结果显示，双柏消肿止痛膏每克平均含量为1 004μg（SRSD=1.1%）。按其含量下浮幅度20%计，则双柏消肿止痛膏每克的盐酸小檗碱含量限度可暂定为不低于803.2μg。

　　5讨论

　　外敷膏剂是中医外治法中常用的药物剂型，除了可用于皮肤、疮疡等疾患，还可用于内科和妇科等病症的治疗。双柏消肿止痛膏是治疗跌打损伤的新一代外科透皮凝胶贴膏剂，经资料整理发现，至今尚未有关于该方剂质量控制的研究。

　　通过查找相关文献并进行反复实验，发现本文建立的当归尾、赤芍的薄层色谱鉴别方法简便、可靠、重现性好、无干扰，可作为双柏消肿止痛膏的定性鉴别方法。用高效液相色谱法对配方中的主要成分黄柏进行含量测定，结果显示，该法灵敏度高、重现性好，可为双柏消肿止痛膏的质量控制和进一步研究提供参考。

参考文献

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　　［2］巫繁菁,韦萍,黄大利,等.骨伤外洗散的薄层色谱及微生物限度检查法适用性实验研究［J］.中国中医药现代远程教育,2023,21(19):136-139.

　　［3］古炳明,邬伟魁,郑珊娜,等.HPLC法测定炎可宁胶囊中盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚［J］.现代药物与临床,2021,36(8):1590-1593.

　　［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［M］.北京:中国医药科技出版社,2020.

　　［5］万勇,杨毅生,付志文,等.高效液相色谱法测定清热解毒颗粒中盐酸小檗碱的含量［J］.药品评价,2021,18(5):269-272.

　　［6］常志惠,胡军华,万亚菲,等.一测多评法同时测定保肾乙丸中5种蒽醌类成分的含量［J］.中国药房,2016,27(36):5156-5159.

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　　［8］王静,岳秀峰.十六味杜鹃花丸中丁香酚含量的GC测定法［J］.职业与健康,2012,28(6):696-697.