摘要：目的：采用化学法合成了一种金属有机框架载体材料，并探索用于乳腺癌高效铁死亡治疗。方法：采用溶剂热合成了一种多孔铁基金属有机框架（Fe-MOF）载体，通过非溶剂法负载双氢青蒿素（DA），并以癌细胞膜进行表面修饰来构建仿生MOF递药系统（R Fe-DA MOFs），并对其形貌、载药量、抗癌活性、抗癌机制等进行系统评价。结果：R Fe-DA MOFs粒径均一，载药量较大，体外抑瘤效果好，细胞ROS含量高，细胞摄取理想，时间越长，摄取越充分。R Fe-DA MOFs的体内效果最强，且生物安全性良好。结论：R Fe-DA MOFs是一种潜在的优异递药系统，对于双氢青蒿素的临床开发具有重要的价值。

　　关键词：ROS；双氢青蒿素；铁基有机框架；乳腺癌

　　迄今为止，乳腺癌的发病率已跃升至所有癌症的首位，乳腺癌已成为全球妇女癌症死亡的主要诱因。因此仍是临床上的一个公开挑战。双氢青蒿素（Dihydroartemisinin，DA）可以通过Fe2+所介导细胞氧化损伤，促进活性氧（ROS）的产生，从而打破乳腺癌细胞的氧化和抗氧化平衡，引发肿瘤铁死亡。铁死亡疗法（Ferroptosis Therapy，FT）是一种与DA相似但不同的肿瘤治疗方法，它利用包括芬顿反应在内的一切方法产生活性氧（ROS）。因此，DA也是一种FT。其抗肿瘤效果和Fe2+有着密切的联系，Fe2+可以还原其内部的过氧桥键，键的断裂会释放有毒自由基，其中就包含ROS，过量的ROS推动脂质过氧化引起肿瘤细胞铁死亡。DA诱导的铁死亡与肿瘤细胞微环境内的Fe2+浓度间存在着正比关系。微环境所含Fe2+浓度越高，其铁死亡效果越明显。但正常人体细胞内，不稳定铁池（LIP）和铁蛋白的存在，使得细胞能够持续且稳定地储存和调控Fe2+，始终维持在一定稳定水平内。因此，单纯依靠肿瘤细胞所含的Fe2+浓度，显然是不足的，DA的铁死亡效果维持在较低的水平内。所以从外部获取更多的Fe2+就显得极其重要。一旦肿瘤微环境的的Fe2+浓度超标，体内Fe2+平衡失调、代谢紊乱，诱导发生芬顿反应，即过量的Fe2+反应形成羟自由基，促进脂质ROS的形成，使细胞发生铁死亡。

　　近来，ROS风暴策略在肿瘤治疗领域得到密切关注。Shen等提出了一种产生ROS风暴的策略，并成功应用于肿瘤高效铁死亡。ROS风暴以产生过量ROS为目的，以细胞铁死亡为基础。通过设计多重ROS释放途径，如芬顿反应和GSH。协同促进细胞内氧化应激水平，实现铁死亡。因此，ROS风暴是一种治疗新颖、富有前途的肿瘤细胞铁死亡诱导方案。基于ROS风暴策略，本文基于前期MOF研究基础上，设计了一种新型仿生MOF递药系统（R Fe-DA MOFs新型递药系统，图1），可产生ROS风暴抑瘤环境，通过铁死亡促癌细胞死亡。主要机制：一是利用癌胞膜伪装递送载体，抑制免疫细胞吞噬，实现血液长循环，将所包覆载体Fe-DA MOFs特异性地同源靶向递送至靶癌细胞。二是Fe-DA MOFs裂解释放的Fe2+显著提高肿瘤内环境的Fe2+浓度，高浓度Fe2+和H2O2之间的芬顿反应可产生ROS，诱导铁死亡。三是大量的DA过氧桥键在Fe-MOFs提供的高浓度Fe2+的催化下断裂释放有毒自由基即ROS，进一步提高细胞氧化应激水平，刺激乳腺癌细胞铁死亡。上述双重、协同促ROS过程，在癌细胞内刺激产生ROS风暴，促进乳腺癌细胞铁死亡。

　　1材料和方法

　　1.1主要材料与仪器

　　双氢青蒿素，上海麦克林生化科技有限公司；NH2-BDC，上海麦克林生化科技有限公司；DMF，上海麦克林生化科技有限公司；FeCl2·4H2O，上海麦克林生化科技有限公司；PBS，中国医药集团有限公司；二甲基亚砜，上海麦克林生化科技有限公司；水为去离子水。

　　UV-1200型紫外可见分光光度计，美国尤尼柯公司；FA2004型电子天平，上海良平仪器仪表有限公司；pHS-3C型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；TDL-80-2B型离心机，上海安亭科学仪器厂；KQ-500DB型数控超声仪，昆山市超声仪器有限公司；JEM-F200型透射电子显微镜，日本电子株式会社。

　　1.2 R Fe-DA MOFs的合成

　　采用溶剂热合成法制备Fe-MOFs，选用四水合氯化亚铁（FeCl2·4H2O）作为铁源，氨基对苯二甲酸（NH2-BDC）为有机配体，甲醇和N，N-二甲基甲酰胺（DMF）为溶剂，在氢氟酸条件下，减少副产物的出现。具体方法如下：取1.12g FeCl2·4H2O和0.5 g NH2-BDC溶于含有100 mL DMF的三颈烧瓶中，再依次加入10 mL甲醇和3 mL的氢氟酸。通入氮气，搅拌加热24 h。冷却至室温，再次使用甲醇和DMF冲洗，晾干。即得到所需Fe-MOFs。

　　取上述制备的干燥Fe-MOFs粉末适量溶于20 mL乙醇中。称取适量双氢青蒿素一并加入。在室温下密封恒温搅拌一段时间，使充分混合。再将混合溶液于旋蒸仪上旋蒸至无溶液，用乙醇冲洗几次，离心，得到产物Fe-DA MOFs。然后再通过超声降解法将经超声处理纯化的细胞膜包裹至Fe-DA MOFs，得到R Fe-DA MOFs。

　　1.3 R Fe-DA MOFs的形态表征

　　称取适量R Fe-DA MOFs，溶于去离子水中，利用激光粒度仪考察其粒径分布和大小。并通过透射电子显微镜观察其外观形态。

　　1.4 R Fe-DA MOFs含药量的测定

　　称取适量制备的R Fe-DA MOFs，溶于1 mol/L HCl中，降低pH，剧烈搅拌使包封的DA从R Fe-DA MOFs中释放出来，反应液15 000 r/min离心10 min后取上清定量，带入DA标曲计算含药量。

　　1.5 R Fe-DA MOFs的体外抗癌评价（MTT）

　　使用小鼠乳腺癌细胞（4T1）评价R Fe-DA MOFs的体外抗癌效果。配制5 mg/mL质量浓度的MTT溶液，备用。将4T1细胞接种到96孔板的细胞培养板中。在37℃下培育24 h，诱导贴壁。然后，分别稀释DA、Fe-DA MOFs和R Fe-DA MOFs至不同浓度。每个浓度分别滴加3个孔，每孔滴加量相同。继续在培养箱中培养24 h。然后采用MTT检测法测量各孔细胞活力。

　　1.6细胞内ROS含量测定

　　如前文所述，R Fe-DA MOFs的抗癌机理与ROS具有密切的联系，高ROS含量最终可以诱导铁死亡，达到抗癌效果。为此计划通过DCFH-DA试剂盒检测4T1细胞在被R Fe-DA MOFs处理过后细胞中的ROS水平。具体方法如下：将4T1细胞接种在六孔板中（1×105细胞/孔），恒温37℃培养24 h使细胞贴壁。其后，将培养的细胞与DA、Fe-DA MOFs和R Fe-DA MOFs继续共同培养24h，三者含有相同浓度的DA（20μg/mL）。培养结束后，用PBS洗涤细胞两次，待DCFH-DA染色完毕，再在37℃的条件下反应30 min。最终，再利用PBS洗涤残留DCFH-DA，并通过倒置荧光显微镜观察和记录细胞内的荧光情况。

　　1.7 R Fe-DA MOFs的细胞摄取

　　将处于对数生长期的4T1肿瘤细胞接种在12孔板中，每孔2×104个细胞，培养24 h（37℃、5%CO2）使其贴壁。稀释R Fe-DA MOFs，使其质量浓度为2 mg/mL。分别向12孔板中加入1 mLR Fe-DAMOFs，在细胞培养箱中继续分别培育1、2、4 h后取出，将细胞用PBS洗涤3次。再加入4%多聚甲醛以固定，最后用倒置荧光显微镜观察荧光所成像，并测定荧光强度。

　　1.8 R Fe-DA MOFs的体内抗癌评价

　　取18~23 g的雌性小鼠，植入4T1细胞，建立小鼠乳腺癌模型。一段适应期后，给小鼠服用R Fe-DA MOFs一周，每日剂量为50 mg/kg，每隔一天记录一次称重，同时记录死亡和进食量等。此外，还需计算肿瘤体积，也为隔天计算一次。第8天处死各组老鼠。解剖小鼠的器官（心、肝、肺等）和肿瘤，进一步观察抗癌情况。

　　2结果和讨论

　　2.1 DA标准曲线

　　为方便后续载药量等实验的考察，根据线性关系得到的数据，绘制双氢青蒿素的标准曲线，如图2所示，得到y=0.008 5x-0.008 7，R2=0.999 4，其中，y是吸光度，x是双氢青蒿素浓度。

　　2.2 R Fe-DA MOFs的表征

　　TEM结果（图3）显示，R Fe-DAMOFs形状圆整，粒径分散均一、粒径约为250 nm。通过使用强酸HCl处理R Fe-DA MOFs使其负载的DA释放，结合标准曲线测得DA载药量为25.1%±1.09%，能满足后续研究需要。综上，本研究成功构建了粒径均一、形状结构理想且载药量较为理想的R Fe-DA MOFs递药系统。

　　2.3 R Fe-DA MOFs的体外抗癌评价

　　通过MTT检测法评价R Fe-DA MOFs对4T1肿瘤细胞的抑制效果，结果如图4所示。图4所示为，DA经负载处理后，在1~10μg/mL质量浓度范围内对4T1细胞表现出明显的抑制效果，结果较为理想。而经过癌细胞膜再修饰后的R Fe-DA MOFs抑制效果再度得到提升，对4T1细胞的活性抑制最高可接近80%，与浓度呈线性关系，即浓度越高，抑制效果越好，4T1细胞存活率越低。结果表明，通过铁基有机框架的负载，DA的抗癌效果能得到明显提升，可能和显著提高了肿瘤细胞内的ROS含量有关。

　　2.4细胞内ROS含量测定

　　ROS含量测定结果如图5所示，在相同培养条件下，空白对照组的荧光强度最低，表明癌细胞虽也含有ROS，但含量过低不足以诱导铁死亡。DA组相比于空白对照组，荧光强度得到增加，正说明DA的抗癌作用是通过ROS所介导的。其次，Fe-DA MOFs组的荧光亮度强于前两组，而R Fe-DA MOFs组的荧光亮度是最强的，这也就说明制备的R Fe-DA MOFs成功在细胞内创造了ROS风暴环境，ROS含量明显高于前两组，明显改善单DA产生ROS不足的问题，铁死亡抗癌效果更理想。

　　2.5 R Fe-DA MOFs的细胞摄取

　　良好的细胞摄取能力是R Fe-DA MOFs入胞发挥药效的关键一步。癌细胞膜可以通过同源靶向和膜融合作用与癌细胞膜相互作用，促进纳米粒子的靶向细胞摄取、采用荧光显微镜考察4T1细胞对R Fe-DA MOFs的摄取能力，4T1细胞和FITC标记的R Fe-DA MOFs共同培育24h，结果如图6所示，R Fe-DA MOFs纳米粒子可以高效摄取入胞，摄取性能较强，这有助于促进药物的有效进入细胞内，提高治疗效果和生物利用率。

　　2.6 R Fe-DA MOFs的体内抗癌评价

　　最后，选用小鼠乳腺癌（4T1）动物模型评价R Fe-DA MOFs的体内抗肿瘤效果。荷瘤小鼠被随机分为4组（n=4），分别为生理盐水、DA溶液、Fe-DA MOFs和R Fe-DA MOFs，经过1周治疗。肿瘤体积变化曲线如图7-1所示。R Fe-DA MOFs在各组中表现最优，肿瘤生长最慢。7 d后，对肿瘤进行称重，Fe-DA MOFs组和R Fe-DA MOFs组的平均瘤重是生理盐水组的38%和31%（图7-2），而R Fe-DA MOFs组的抑瘤效果最显著。此外，治疗期间各治疗组小鼠的体重与对照组相比，没有显著差异（图7-3），说明R Fe-DA MOFs具有良好生物安全性。综上，R Fe-DA MOFs抑瘤活性最好，且生物相容性较好，可以作为潜在的治疗药物。

　　3结论

　　本研究基于ROS风暴策略，选用Fe-MOFs载体，成功构建R Fe-DA MOFs新型仿生递药系统，粒径均一且形状结构理想，载药量较大。细胞水平研究发现，R Fe-DA MOFs摄取性能优异，可诱发ROS风暴积累，增强了乳腺癌细胞的铁死亡。动物水平发现，R Fe-DA MOFs可以通过ROS风暴取得显著的抑瘤效果，且生物相容性好。所以，R Fe-DA MOFs递送系统为临床ROS风暴抗癌治疗开发提供了新的范式。

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