摘要： 目的：分离和鉴定河北省唐山地区奶牛临床型乳腺炎源葡萄球菌，并了解其药敏情况。方法：选择河北省唐山地区 某规模化大型奶牛养殖场发生的60例临床型乳腺炎源葡萄球菌病的奶牛乳汁作为临床样本，进行病原菌分离鉴定、革兰氏 染色镜检、 PCR扩增鉴定和药敏试验。结果：共分离培养获得金黄色葡萄球菌和产色金黄色葡萄球菌2种类型的葡萄球菌， 呈革兰氏阳性。 PCR检测可扩增出一大小为1 459 bp的特异性条带，分离培养的2株葡萄球菌的蔗糖、麦芽糖、 N-乙酰葡萄 糖胺、甘露糖、果糖、甘露醇、尿素、精氨酸双水解、硝酸盐还原试验为阳性。金黄色葡萄球菌对克林霉素、红霉素、氧 氟沙星、头孢噻吩、四环素5种抗菌药物敏感，产色葡萄球菌除了红霉素外，其余11种抗菌药物均敏感。结论：该研究为提 高奶牛临床型乳腺炎源葡萄球菌病的治疗效果奠定基础，也为今后本地区奶牛乳腺炎的科学防治提供参考价值。

　　关键词： 奶牛;临床型乳腺炎;葡萄球菌;分离鉴定

　　Isolation and Identification of Staphylococcus Aureus from Clinical Mastitis in Dairy Cows in

　　Tangshan Area

　　LI Chunfang1 ，CHEN Yanli2* ，LIU Zhiyong1 ，ZHANG Xiaoli1

　　( 1. Tangshan Animal Epidemic Prevention and Control Center ，Tangshan Hebei 063000 ，China;

　　2. Tangshan Academy of Agricultural Sciences ，Tangshan Hebei 063000 ，China )

　　Abstract：Objective ：To isolate and identify Staphylococcus aureus from clinical mastitis of cows in Tangshan area ，Hebei Province ，and to understand its drug sensitivity .Method ：The 60 cases of clinical mastitis related Staphylococcus aureus disease in a large-scale dairy farm in Tangshan ，Hebei Province were selected as clinical samples for pathogen isolation and identification，Gram staining microscopy ，PCR amplification identification ，and drug sensitivity testing .Result ：The results showed that two types of Staphylococcus aureus，Staphylococcus aureus and Staphylococcus aureus chromogene ，were co isolated and cultured，and they were Gram positive .PCR detection can amplify a specific band with a size of 1459 bp .The sucrose ，maltose，N-acetylglucosamine ，mannose ，fructose ，mannitol ，urea ，arginine double hydrolysis ，and nitrate reduction tests of the two strains of Staphylococcus isolated and cultured were positive .Staphylococcus aureus is sensitive to five antibiotics ，including clindamycin ，erythromycin ，ofloxacin ，cefotaxime ，and tetracycline .Except for erythromycin ，all 11 other antibiotics are sensitive to Staphylococcus aureus chromogenes .Conclusion ：This study lays the foundation for improving the therapeutic effect of clinical mastitis associated Staphylococcus aureus in cows ，and also provides reference value for the scientific prevention and treatment of mastitis in local cows in the future .

　　Keywords ：cows ，clinical mastitis，Staphylococcus ，separation and identification

　　引言

       奶牛乳腺炎是奶牛养殖中最常见的疾病之一，其病 因多种多样，如饲养管理条件、环境理化因素、病原微生物感染、机体自身免疫力等因素均可诱导本病的发 生，其发病率一直较高，近年还呈现明显的上升趋势[1] 。 在兽医临床上，根据是否表现出临床症状将奶牛乳腺炎一般分为临床型乳腺炎和隐性2种类型[2] 。一旦奶牛发生 临床型乳腺炎，其临床主要表现为产奶量下降、乳汁变 质、乳房炎症等，甚至还会导致奶牛生殖机能紊乱、发 情周期延迟、生产繁殖性能下降，严重影响着奶牛这一 畜牧养殖业的发展[3-5] 。因此，本研究拟对河北省唐山地 区某规模化大型奶牛养殖场发生的60例临床型乳腺炎源 葡萄球菌病的奶牛进行病原菌分离鉴定，并开展相关的 药敏试验，以期提高奶牛临床型乳腺炎源葡萄球菌病的 治疗效果，为今后本地区奶牛乳腺炎的科学防治提供参 考价值。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 病料来源

　　选择河北省唐山地区某规模化大型奶牛养殖场2023 年1—10月发生的60例临床型乳腺炎源葡萄球菌病的奶 牛乳样作为临床样本，乳汁发生明显的变质，呈黄色或 白色絮状样。

　　1.1.2 主要试剂

　　血琼脂培养基(广州市迪景微生物科技有限公 司)、胰蛋白胨大豆肉汤(广东环凯微生物科技有限公 司)、革兰氏细菌染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公 司)、细菌基因组DNA 提取试剂盒(美国OMEGA公 司)、 Taq聚合酶(TaKaRa)、细菌生化鉴定管(杭州 滨和微生物试剂有限公司)、药敏试纸片(英国Oxoid 公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 病原菌的分离培养与镜检

　　取20 μ L 乳汁样本转移至一洁净的离心管内， 10 000 r/min离心10 min。吸除上层清液，向下层沉淀物 中添加胰蛋白胨大豆肉汤，反复吹打，充分悬浮沉淀， 转移至37 ℃恒温震荡培养箱内进行培养， 180 r/min ， 24 h。在血琼脂培养基上进行接种培养，采用四区划线 法，培养16 h，观察培养基上细菌的生长情况和菌落状 况。挑取单克隆菌落，按照革兰氏细菌染色试剂盒操作 说明步骤进行细菌染色，至于显微镜下进行观察，并做 好记录。

　　1.2.2 PCR检测

　　使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离培养的 葡萄球菌基因组DNA，作为PCR扩增的模板。使用特 异性引物16S-F/16S-R( GAGTTTGATCCTGGCTCA/ ACGGCTACCTTGTTACGA)对葡萄球菌目标基因16S DNA进行PCR扩增检测。 PCR反应体系为2 μL 10 ×PCR 缓冲液、 2 μL上游引物、 2 μL下游引物、 2.5 μL氯化 镁、 1 μL dNTPs 、0.5 μL Taq聚合酶、 2 μL模板基因 组DNA，添加灭菌双蒸水补齐至20 μL的反应体系。 PCR反应参数为94 ℃预变性5 min;95 ℃变性45 s ，52 ℃退火40 s ，72 ℃延伸50 min，共30个循环; 72 ℃继续延 伸5 min ，4 ℃保存。将PCR扩增产物使用1.5%浓度的琼 脂糖凝胶电泳进行鉴定。

　　1.2.3 生化鉴定

　　按照细菌生化鉴定管操作使用说明的中规定的步骤 进行试验，使用接种环挑取培养基上形成的单克隆菌株 接种至细菌生化鉴定管内，培养24 h后，观察生化鉴定 管中的颜色变化。

　　1.2.4 药敏试验

　　选取100 μL悬浮菌液滴入血琼脂培养基上，使用接 种棒均匀涂布， 室温静置10 min。待干燥后，使用无菌 外科手术镊夹取药敏试纸片轻轻放置到琼脂表面，相邻 试纸片间隔不得小于24 mm ，室温静置20 min。待试纸 片紧贴琼脂后，转移至37 ℃恒温培养箱内静置培养 24 h ，观察细菌药敏试验情况，并做好记录。

　　2 结果

　　2.1 病原菌的分离鉴定

　　60份乳汁样本经血琼脂培养基培养后，可观察到2种形态，其中一种分离培养菌呈灰白色菌落，湿润光 滑，菌落个体较大，菌落周围形成溶血环，疑似金黄色 葡萄球菌;另一种分离培养菌呈浅黄色或黄色菌落，中 等大小，具有明显的分界限，疑似产色葡萄球菌。经革 兰氏染色后镜检，该病原菌为革兰氏阳性菌，呈双球形 或椭圆形或短链状排列。

　　2.1.1 PCR扩增鉴定

　　使用特异性引物16S-F/16S-R对临床型乳腺炎葡萄 球菌病的奶牛乳汁样本分离培养的细菌进行PCR扩增检 测，在琼脂糖凝胶电泳上可见一大小为1 459 bp的特异 性条带，而阴性对照则未出现任何电泳条带，与预期目 标结果相符合。电泳图谱见图1.

　　2.1.2 生化鉴定结果分析

　　从表1中生化鉴定情况可知，分离培养获得的2株 葡萄球菌的蔗糖、麦芽糖、 N - 乙酰葡萄糖胺、甘露 糖、果糖、甘露醇、尿素、精氨酸双水解、硝酸盐还原 试验结果呈现为阳性，金黄色葡萄球菌的葡萄糖磷酸盐 蛋白胨水试验结果呈现为阳性，产色葡萄球菌的乳糖试 验结果呈现为阳性，其他生化鉴定项目试验结果呈现为 阴性。

　　2.1.3 药敏试验结果分析

　　经分离培养的金黄色葡萄球菌对克林霉素、红霉 素、氧氟沙星、头孢噻吩、四环素5种抗菌药物敏感， 对卡那霉素、庆大霉素、复方新诺明、氨苄西林4种抗 菌药物耐药，对氟哌酸、环丙沙星、青霉素G 3种抗菌 药物中性。分离培养的产色葡萄球菌对卡那霉素、庆大 霉素、克林霉素、氟哌酸、氧氟沙星、环丙沙星、复方 新诺明、头孢噻吩、氨苄西林、青霉素G、四环素11种 抗菌药物敏感，对红霉素中性。

　　3 讨论

　　奶牛乳腺炎是奶牛养殖场中最常见的、最难防治的 疾病之一，主要是由物理、化学和病原微生物等致病因 素引起的一类炎症性疾病。据相关数据统计，世界各 地奶牛乳腺炎发病率均较高，平均在25% ～ 60%。我国 奶牛乳腺炎的发病率最高70%甚至更高，每年给奶牛养 殖业造成巨大的经济损失[6] 。有研究报道表明，葡萄球 菌是感染奶牛引发临床型乳腺炎的主要病原体之一，且 大多数奶牛乳腺炎均会伴有葡萄球菌感染，该病原菌属 于葡萄球菌属细菌，革兰氏染色呈阳性，没有芽孢和荚 膜，也没有鞭毛，不会产生运动功能，在培养基上呈现 双球形或椭圆形，常以短链状进行排列[7-8]。

　　本研究中在患有临床型乳腺炎的奶牛乳汁样本里共 分离鉴定获得2种类型的葡萄球菌， 分别是金黄色葡萄 球菌和产色葡萄球菌，是近年引起奶牛临床感染的重要 致病菌之一，对奶牛的健康造成极大的威胁。因此，在 畜牧养殖业中需要对葡萄球菌进行诊断的分离培养和鉴 定，这样才能够更好地防治由该病原菌感染所引发的疾 病。曹海南等[9]在2021年对江苏省部分奶牛养殖牧场发 生的临床型乳腺炎源病原菌进行分离鉴定，结果显示不 同地区、不同牧场、不同月份的乳腺炎源致病菌分布各不相同。张晓光等[10]通过对长春市某大型规模化养殖场 中的奶牛乳腺炎致病菌分离鉴定和药敏试验的研究，结 果表明阿米卡星和庆大霉素是该地区乳腺炎的首选抗菌 药物。本研究主要选择河北省唐山地区某规模化大型奶 牛养殖场发生的60例临床型乳腺炎源葡萄球菌病的奶牛 进行病原菌分离鉴定，并开展相关的药敏试验，结果表 明在病牛的乳汁样本中共分离获得金黄色葡萄球菌和产 色葡萄球菌2种类型的葡萄球菌， 并进一步深入开展了 PCR鉴定、生化鉴定和药敏试验，成功分离鉴定了导致 乳腺炎发生的葡萄球菌这一致病菌。

　　4 小结

　　本研究对河北省唐山地区某规模化大型奶牛养殖场 发生的60例临床型乳腺炎源葡萄球菌病的奶牛进行病原 菌分离鉴定，并开展相关的药敏试验，为提高奶牛临床 型乳腺炎源葡萄球菌病的治疗效果奠定基础，也为今后 本地区奶牛乳腺炎的科学防治提供参考价值。

　参考文献

　　[1] 刘荣慧，寇茜茜，张伟， 等.石河子地区奶牛临床型乳腺炎 源葡萄球菌的分离鉴定与药敏试验[J] . 黑龙江畜牧兽医， 2023( 12 )：92-96 ，146-147 .

　　[2] 赵静雯，邵雯， 徐崇，等 .江苏部分地区奶牛乳腺炎病原菌 流行病学调查及葡萄球菌耐药性分析[J] . 中国兽医学报， 2022 ，42( 8 )： 1 597-1 601 .

　　[3] 张蕾， 陈亮，冯万宇，等 .奶牛隐性乳腺炎现场诊断技术研 究进展[J] .现代畜牧科技， 2021.( 12 )：4-7 ，10 .

　　[4] 张蕾， 陈亮，冯万宇，等 .一株奶牛乳房炎致病性大肠杆菌 的分离鉴定和药敏试验[J] . 四川畜牧兽医， 2023 ，50( 3 )：23-24 ，27 .

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　　[8] 朱俊平. 山东省东营市奶牛乳腺炎致病菌的分离鉴定及药敏 试验[J] . 中国动物检疫， 2020 ，37( 8 )： 100-104 .

　　[9] 曹海南，徐崇，赵静雯，等.2021年江苏省部分牧场奶牛临床 型乳腺炎源病原菌的分离鉴定及地区、月份分布情况分析[J] . 黑龙江畜牧兽医， 2023( 12 )：81-86 .

　　[10] 张晓光，李子亨，刘海瑶，等.长春市某奶牛场乳腺炎病原 菌的分离鉴定及耐药性分析[J] . 中国兽医杂志， 2023 ，59(4 )：52-58 .