摘  要：芽孢杆菌来源的纤维素酶具有耐热耐碱等优良催化特性，故而受到了广泛关注。本研究利 用筛选的芽孢杆菌B55 发酵生产羧甲基纤维素酶，在确定碳源、氮源、金属盐、羧甲基纤维素添加 量、接种量等对菌株产酶影响的基础上，进行正交试验优化以确定最佳发酵培养工艺。研究结果表 明：最佳培养工艺的配方为 30 g/L 甘油、5 g/L 葡萄糖、3 g/L 大豆蛋白胨、16 g/L 酵母浸粉、4 g/L 羧 甲基纤维素、3 g/L 磷酸氢二钾，3 g/L 磷酸二氢钠，pH 7.0，在 4%（V/V）接种量、培养温度 32 ℃的条 件下，发酵 48 h 获得最大酶活力 401.34 U/mL，具备规模生产的应用潜力。

　　关键词：羧甲基纤维素酶；芽孢杆菌；培养优化；发酵生产

　　木质纤维素是世界上最丰富的可再生资源，占 全球生物总量的 80%以上，是自然界分布最广、含  量最多的一种多糖，纤维素酶可以将纤维素转化成 可利用性糖类，是开发利用木质纤维素的关键[1-2]。 纤维素酶是一类可以水解 β-1，4 葡萄糖苷键，使纤 维素分解为纤维二糖和葡萄糖的酶系总称，包括内 切葡萄糖苷酶（endoglucanase，EC 3.2.1.4，又称羧甲 基纤维素酶）、外切葡萄糖苷酶（cellobiohydrolase， EC 3.2.1.91，又称微晶纤维素酶）和 β-葡萄糖苷酶 (β-glucosidase，EC 3.2.1.21）[3 -4] 。羧甲基纤维素酶 （CMCase）是内切型纤维素酶，作用于纤维素的 β -  1，4 糖苷键上，其活力会直接影响纤维素的水解效 率[5]。

　　纤维素酶除了可用于木质纤维素降解，在酿造、 饲料、中药提取、纺织、造纸、洗涤等行业领域也得到  了广泛应用[6-8]。作为目前糖苷酶类中尚存在大量亟  待解决问题的一类酶，如何提高酶的活力并研发适  应催化条件的纤维素酶成为了当前的主要研究趋  势[9] 。随着亿万年的自然演化，众多产纤维素酶的细  菌、真菌和放线菌等被陆续发现[10-11]。作为芽孢杆菌  类细菌来源的纤维素酶拥有耐热、耐碱等优良催化特性，近年来其在饲料添加剂等领域的应用备受重 视[12-13] 。芽孢杆菌所产的纤维素酶以羧甲基纤维素 酶为主[14]。本文通过对分离自近海土壤中能降解羧 甲基纤维素的芽孢杆菌 B55 培养优化过程的研究， 挖掘其产 CMCase 的潜力，以期为后续的相关应用 性研究提供数据依据和理论支撑。

　　1   材料与方法

　　1.1   材料

　　分离筛选自山东烟台近海土壤的芽孢杆菌 （Bacillus sp.）B55，现保存于鲁东大学应用微生物研 究所。 羧甲基纤维素（CMC）购自生工生物工程（上 海）股份有限公司，其余所用试剂均为分析纯或生物 纯。

　　1.2   方法

　　1.2.1   菌种活化

　　试管斜面保藏的 Bacillus sp. B55 转接活化培 养基 ，在 30 ℃、200 r/min 的条件下培养至菌体浑 浊。活化培养基：10 g/L 蛋白胨，5 g/L 酵母粉，10 g/L 氯化钠，pH 6.5，121 ℃灭菌 15 min。

　　1.2.2   培养优化

　　将一定量的活化菌种接入发酵培养基，在 30  ℃、200 r/min 的条件下，确定碳源、氮源和金属盐、 CMC 添加量、接种量对菌种产 CMCase 的影响，发  酵培养 24 h 后测定CMCase 的活力。根据影响因素 的优化结果，正交试验确定菌株 B55 产 CMCase 的 最佳变量值，通过最佳培养工艺确定最佳产酶条件。

　　1.2.3   酶活和菌浓测定[15]

　　培养液经 10 000 r/min 离心 5 min 去菌体后获 得上清酶液，取 1 mL 适当稀释度的酶液，在其中添 加 1 mL1% CMC 底物溶液，45 ℃水浴保温反应 20 min 后，加入 3 mLDNS 试剂，沸水浴 5 min 显色并定 容至 25 mL 后，取 4 mL 反应样液以 8 000 r/min 离 心 5 min。取离心后的上清液，在 540 nm 处测定吸 光度值，根据葡萄糖标准曲线计算酶活力。以单位 体积（mL）、单位时间（min）水解羧甲基纤维素所产 生葡萄糖的 μg 数为酶活力单位。

　　发酵培养液加纯净水稀释至适当浓度，并以纯 水作为空白对照，在 600 nm 处测定吸光度，以 OD600 指示菌体浓度。

　　2   结果与讨论

　　2.1   碳源对菌株 B55 产 CMCase影响

　　采用发酵培养基：20 g/L 碳源，2 g/L CMC，5 g/L 酵母浸粉，10 g/L 大豆蛋白胨，3 g/L 磷酸氢二钾，3 g/L 磷酸二氢钠，pH 7.0。在 30 ℃、200 r/min 条件下 摇床培养 24 h，碳源对菌株产 CMCase 活性影响见 图 1。结果显示，以甘油为碳源时获得最大 CMCase 活性 146.45 U/mL，其次为葡萄糖（130.27 U/mL）。

　　2.2   氮源对菌株 B55 产 CMCase 影响

　　采用发酵培养基：20 g/L 甘油，15 g/L 氮源，2 g/  L CMC，3 g/L 磷酸氢二钾，3 g/L 磷酸二氢钠，pH  7.0。在 30 ℃、200 r/min 的条件下摇床培养 24 h，氮 源对菌株产 CMCase 活性的影响见图 2。由图中结 果可知 ，最佳产酶氮源为大豆蛋白胨 ，产酶量为 153.24 U/mL；酵母粉、尿素、磷酸氢二铵为氮源时， CMCase 产量也相对较高。

　　2.3   金属盐对菌株 B55 产 CMCase 影响

　　选取发酵培养基：20 g/L 甘油，15 g/L 大豆蛋白 胨，2 g/L CMC，3 g/L 磷酸氢二钾，3 g/L 磷酸二氢 钠，3 g/L 金属盐，pH 7.0。在 30 ℃、200 r/min 的条件 下摇床培养 24 h，金属盐对菌株产 CMCase 活性的 影响见图 3。由图 3 可以看出，额外再添加金属盐会 对菌株产 CMCase 的活力产生负影响；与对照组相 比，添加金属盐组的 CMCase 活力均得到了不同程 度的降低。

　　2.4   CMC 添加量对菌株 B55 产 CMCase 影响

　　纤维素酶属于水解酶，多为诱导酶，合适的诱导 物添加量可以显著提升纤维素酶的产量[16] 。选用发 酵培养基：20 g/L 甘油，15 g/L 大豆蛋白胨，3 g/L 磷 酸氢二钾，3 g/L 磷酸二氢钠，不同浓度的 CMC，pH 7.0。在 30 ℃、200 r/min 的条件下摇床培养 24 h，诱 导物 CMC 对菌株产 CMCase 活性的影响见图 4。由 图 4 可以看出，随着底物 CMC 添加量的增加，酶活 性逐渐增加，当诱导物添加至一定量时，即质量浓度 为 2~4 g/L 时，酶产量相对稳定，其中添加量为 4 g/L CMC 时可获得最大 CMCase 活力，为 166.69 U/mL。

　　2.5   接种量对菌株 B55 产 CMCase影响

　　选取如下培养基组分：20 g/L 甘油，15 g/L 大豆 蛋白胨，3 g/L 磷酸氢二钾，3 g/L 磷酸二氢钠，4 g/L CMC，pH 7.0。装液量 100 mL/500 mL 瓶，每瓶接种 不同量的活化菌种，在 30 ℃、200 r/min 的条件下摇 床培养 24 h，确定接种量对菌株 B55 产 CMCase 的影响。由图 5 可以看出，菌株 B55 产 CMCase 的最佳 接种量是 4%（V/V），酶活力为 167.24 U/mL。

　　2.6   正交试验优化

　　根据对菌种进行单因素优化所得出的结论，选 取甘油、葡萄糖、大豆蛋白胨、酵母粉、CMC、接种量、 温度等 7 项变量进行 7 因素 2 水平的正交试验设 计，其因素和水平见表 1。

　　根据所列的 7 因素和 2 水平的条件，利用正交试验设计软件进行正交试验设计，结果见表 2。

　　根据极差 R 值分析可知，在正交试验的 7 个因 素中，甘油对菌株 CMCase 产量的影响最大，其次是 酵母粉、接种量、培养温度、大豆蛋白胨和葡萄糖。通 过对 k1、k2 值的比较分析，确定 7 个因素的最佳变量 值分别为 30 g/L 甘油、5 g/L 葡萄糖、3 g/L 大豆蛋白胨、16 g/L 酵母浸粉、4 g/L CMC、4%（V/V）接种量和 培养温度 32 ℃。

　　2.7   发酵培养曲线

　　结合培养因素对菌株产酶的影响和正交试验优 化结果，确定 Bacillus sp. B55 发酵生产 CMCase 的 最佳培养组分为 30 g/L 甘油、5 g/L 葡萄糖、3 g/L 大 豆蛋白胨、16 g/L 酵母浸粉、4 g/L CMC、3 g/L 磷酸 氢二钾，3 g/L 磷酸二氢钠，pH 7.0；最佳发酵条件为 4%（V/V）接种量、培养温度 32 ℃、装液量 100 mL/ 500 mL。采用优化过的培养工艺，Bacillus sp.B55 发 酵生产羧甲基纤维素酶的培养曲线见图 6 ，在经短 暂停滞期后快速进入对数生长期，在 36 h 时菌体浓 度达到最大，为 45.32（OD600），随后进入静止期，菌 体浓度缓慢下降。

　　对 CMCase 而言，在菌体快速增殖阶段，酶表达 量会随菌体浓度增加而快速上升，当菌体生长进入 静止期后，酶活性仍呈增长趋势，在发酵 48 h 时获 得最大酶活性 401.34 U/mL。因此，Bacillus sp. B55 生产 CMCase 的过程为非生长偶联型（滞后合成 型），会受到分解代谢物的阻遏。发酵时间超过 66 h 后，菌体开始自溶，酶活性快速降低。

　　3   结语

　　芽孢杆菌属微生物具有较强的耐热性，所产纤 维素酶多为碱性纤维素酶，因此在饲料、洗涤、食品 等领域得到了广泛应用[17]。本研究首先优化确定了 Bacillus sp. B55 产 CMCase 的影响因素，并在此基 础上通过正交试验确定各变量因素的最佳变量值。 研究结果显示 ，使用优化的培养工艺发酵生产CMCase ，发酵 36 h 可获得最大菌体浓度 45.32 （OD600），48 h CMCase 活力为 401.34 U/mL。该研究 成果可为后续进行规模化制备与催化特性研究提供 良好的数据支撑。此外，本研究所用的产酶菌株为耐 热芽孢杆菌 ，属于潜在益生菌 ，可将 CMCase 和 Bacillus sp. B55 菌体一并作为饲用微生态制剂用于 饲料行业。

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